鮑悅，孫尚志，孫佳明，張輝*

(1.長春中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長春 130117；2.拜泰齊貿(mào)易(上海)有限公司，上海 201203)

·中藥工業(yè)·

陶瓷膜過濾在分離提取中國林蛙皮中透明質(zhì)酸的應(yīng)用研究△

鮑悅1，孫尚志2，孫佳明1，張輝1*

(1.長春中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長春 130117；2.拜泰齊貿(mào)易(上海)有限公司，上海 201203)

目的：研究陶瓷膜過濾技術(shù)對中國林蛙皮中透明質(zhì)酸(HA)的純化工藝。方法：以膜通量或截留率為指標，運用單因素試驗優(yōu)選中國林蛙皮中HA的陶瓷膜純化工藝參數(shù)。結(jié)果：陶瓷膜最佳的分離純化條件為孔徑500 nm，操作壓力0.1 MPa，濾過25 min，HA截留率91.67%；HA中葡萄糖醛酸質(zhì)量分數(shù)為36.68%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為0.58%，該純度已達到化妝品級別。結(jié)論：該陶瓷膜過濾工藝適用于純化中國林蛙皮中的HA，對中國林蛙的產(chǎn)業(yè)化起到一定的促進作用。

陶瓷膜過濾；中國林蛙皮；透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸(HA)是一種高分子量的直鏈多糖，早在1934年Meyer和Palmer[1]首次從牛眼的玻璃體組織中分離出玻璃酸及其鈉鹽，命名為HA。HA是一種重要的醫(yī)藥用原料，同時也是理想的保濕劑和良好的透皮吸收促進劑，并且還是理想的天然保濕因子。二十幾年來，國內(nèi)外學者對其理化性質(zhì)，生理功能以及應(yīng)用[2-12]進行了較為全面，系統(tǒng)的研究。

在前人對HA以及陶瓷膜過濾技術(shù)的研究[13-16]基礎(chǔ)上，改進HA的陶瓷膜過濾工藝，以陶瓷膜過濾方法替代了傳統(tǒng)的有機溶劑法來去除中國林蛙皮提取物中的蛋白。吉林省的中國林蛙資源較為豐富，將優(yōu)化后的膜分離工藝應(yīng)用于中國林蛙皮中HA的分離純化，使其純度達到化妝品級別，能為林蛙整個行業(yè)的發(fā)展帶來較為可觀的經(jīng)濟效益。

1 儀器與材料

1.1 儀器

低速大容量多管離心機，低溫超速離心機，KQ-100型超聲波清洗器，陶瓷膜過濾設(shè)備，DZF-6050型真空干燥箱，PHS-2C型精密酸度計，紫外可見分光光度計(Cary 50 UV-Vis)等。

1.2 材料

胃蛋白酶(1∶3000)(中國惠世化學試劑有限公司)，三氯醋酸(沈陽市新西試劑廠)，高嶺土(廣東省汕頭市西隴化工廠)，氯化鈉、95%乙醇、無水乙醇(北京化工廠)，鹽酸(天津市大茂化學試劑廠)。

中國林蛙皮，源自吉林省輝南縣的野生健康林蛙，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學張輝教授鑒定為林蛙Ranatemporariachensinensis的皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 HA的提取

選擇取油后的中國林蛙皮，粉碎，加10倍量水浸泡24 h，以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速勻漿3 min，勻漿后成糊狀，攪拌加熱至90 ℃，保溫10 min，冷卻至50 ℃，自溶12 h，4000 r·min-1離心除去殘渣，殘渣用4倍量水洗滌兩次，得HA粗提取液。

2.2 HA的陶瓷膜過濾

2.2.1 截留率的測定 精密稱取葡糖醛酸(AR)20 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。按照葡糖醛酸含量測定方法，在530 nm處測定吸光度，以吸光度對質(zhì)量濃度作圖，繪制葡糖醛酸含量的標準曲線，得回歸方程：Y=0.012X-0.002 7，r=0.999 2。

取上述HA粗提取液4000 mL，在操作壓力為0.1 MPa，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進行濾過25 min。取濾過前的原液和截留液按照上述標準曲線的方法進行葡糖醛酸含量的測定，得出相應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為C1和C2，按公式計算得出相應(yīng)的截留率。

截留率(%)=(1-C2/C1)×100%

(1)

2.2.2 膜孔徑的確定 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，在操作壓力為0.1 MPa，以孔徑500 nm和孔徑100 nm兩種規(guī)格的陶瓷膜，比表面積0.5 m2分別進行濾過25 min，按照上述截留率的測定方法進行測定，以陶瓷膜對HA的截留率為考察指標，考察兩種規(guī)格的陶瓷膜在截留HA的差異，結(jié)果截留率分別為91.67%、93.85%。

2.2.3 操作壓力對膜通量的影響 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進行濾過25 min，考察陶瓷膜工作過程中膜通量(mL·cm-2·h-1)隨壓力的變化，結(jié)果見圖1。

圖1 操作壓力對中國林蛙HA膜通量的影響

2.2.4 膜通量隨時間的變化 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，在操作壓力為0.1 MPa，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進行濾過，考察陶瓷膜工作過程中膜通量(mL·cm-2·h-1)隨時間的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 時間對中國林蛙膜通量的影響

2.2.5 HA的陶瓷膜過濾最佳工藝 取上述HA粗提取液4000 mL，用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0，在0.1 MPa陶瓷膜操作壓力下，以孔徑500 nm、比表面積0.5 m2進行濾過25 min，截留液干燥得HA精制品。

2.3 HA的純化

對上述經(jīng)過陶瓷膜過濾得到的HA精制品進一步純化，按照1∶30的比例加入水，同時加入溶液體積3%的高嶺土50 ℃加熱30 min，離心，少許水洗滌殘渣，離心，水液合并，放冷至0～4 ℃，加入三氯醋酸飽和溶液，使溶液中三氯醋酸濃度達到8%，靜置30 min后，離心，取上清液加入氯化鈉使溶液中氯化鈉的質(zhì)量分數(shù)為2.93%，加入3倍量的95%乙醇，靜置24 h，抽濾，依次用95%乙醇、無水乙醇洗滌產(chǎn)品，重復醇沉1次，得到HA純品[17]。

2.4 HA的純度測定

2.4.1 HA中葡糖醛酸含量測定 目前國內(nèi)外一般以葡糖醛酸含量表示HA的純度，根據(jù)HA的結(jié)構(gòu)計算，每100 mg透明質(zhì)酸鈉純品完全水解后可產(chǎn)生葡萄糖醛酸48.38 mg、氨基葡萄糖44.65 mg[18]。精密稱取HA純品100 mg置100 mL的容量瓶中，加雙蒸水定容，取該溶液1 mL，按照2.2.1項下的方法測定，經(jīng)計算得樣品中的葡萄糖醛酸質(zhì)量分數(shù)為36.68%。

2.4.2 HA中蛋白質(zhì)含量測定 精密稱取牛血清蛋白(BSA)25 mg，置于100 mL量瓶中，用0.15 mo1·L-1氯化鈉溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg· mL-1的蛋白溶液[19]。按照考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量的方法，以BSA微克數(shù)對吸光度作圖，得標準曲線為Y=0.001 8X+0.010 5，r=0.992 9。精密稱取HA純品500 mg，按照標準曲線的方法進行測定，從標準曲線得到蛋白質(zhì)的質(zhì)量，以此計算HA純品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為0.58%。

3 討論

孔徑500 nm截留分子量100萬道爾頓和孔徑100 nm截留分子量30萬道爾頓這兩種規(guī)格的陶瓷膜，在HA的截留率上沒有較大的差別，基于盡量除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的同時減少耗能的原則，所以選擇孔徑500 nm的陶瓷膜；陶瓷膜在一定壓力范圍內(nèi)，膜通量與壓力差呈正比，但隨著壓力差增大到一定程度，膜通量反而有減小的趨勢。壓力應(yīng)控制在0.1～0.15 MPa較為適宜，由于壓力在0.1 MPa的時候，膜通量基本達到峰值，壓力為0.15 MPa時的膜通量較壓力為0.1 MPa時的膜通量并沒有較大的增長，并且同時增加了設(shè)備的負荷和耗能，故壓力選擇0.1 MPa；HA通過陶瓷膜的膜通量隨時間延長而衰減，經(jīng)過一定時間后，達到穩(wěn)定狀態(tài)，膜通量基本保持不變。從膜在單位壓力下的自來水通量(5.7 mL·cm-2·h-1)與過濾25 min時的膜通量(2.23 mL·cm-2·h-1)相比，可知膜通量在25 min左右降低了60%左右，因此濾過時間確定為25 min。

在應(yīng)用陶瓷膜濾過分離HA時，當pH調(diào)到1.7～3.3時，HA易發(fā)生可逆的交聯(lián)反應(yīng)，增大了分子直徑，可以有效提高HA的截留率，因此采用濃鹽酸調(diào)pH值為2.0。據(jù)文獻報道應(yīng)用于化妝品級別的HA的平均分子量在300萬道爾頓左右[20]，在應(yīng)用陶瓷膜過濾工藝時，大部分蛋白質(zhì)可以透過陶瓷膜，但仍有一部分蛋白質(zhì)因其分子量大于100萬道爾頓而與HA一同被截留下來，故采用三氯醋酸對陶瓷膜濾過得到的HA精制品進行進一步的純化，提高其純度。

將優(yōu)化后陶瓷膜分離工藝應(yīng)用于中國林蛙皮中HA的分離，使得每千克林蛙皮可收到2.8 g HA純品，對其中HA進行含量測定，其葡萄糖醛酸質(zhì)量分數(shù)為36.68%。由于化妝品級HA含葡萄糖醛酸為35%～45%，醫(yī)藥級HA含葡萄糖醛酸量為42%～48%，因此應(yīng)用陶瓷膜過濾純化得到的中國林蛙皮HA已達到化妝品級別。另經(jīng)測定純化后的HA中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為0.58%，可知其中的蛋白質(zhì)含量很低，故陶瓷膜過濾在分離提取中國林蛙皮中HA有著較好的效果。陶瓷膜過濾分離技術(shù)將對中國林蛙皮中HA的規(guī)范化和標準化生產(chǎn)起到一定的促進作用。

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ApplicationofCeramicMembraneFiltrationinExtractionofHyaluronicAcidfromSkinofRanatemporariachensinensis

BAOYue1，SUNShangzhi2，SUNJiaming1，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，TraditionalChinesemedicineandbiologicalengineeringresearchanddevelopmentcenter，Changchun130117，China；2.BiotageTrading(Shanghai)Co.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Objective：To purify hyaluronic acid (HA) from the skin ofRanatemporariachensinensisby ceramic membrane filtration.Methods：Using membrane flux or rejection as the index，the purification process parameters of HA in the skin was optimized by single factor experiments.Results：Best of ceramic membrane separation and purification conditions：pore size of 500 nm，operating pressure of 0.1 MPa，filtration 25 min，HA retention rate of 91.67%.Glucuronic acid in HA content of 36.68%，0.58% protein content，the purity has reached the cosmetic grade.Conclusion：The ceramic membrane filtration process is suitable for the purification of HA in the skin of Chinese forest frog，it can promote the industrial utilization ofR.temporariachensinensis.

Ceramic membrane filtration；the skin ofRanatemporariachensinensis；hyaluronic acid

2015-04-10)

國家中醫(yī)藥行業(yè)專項(2015468002-2)

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張輝，教授，博士生導師，研究方向：中藥化學成分與應(yīng)用開發(fā)；E-mail：Zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.016