李瑤，管淑玉，李將，王群，鄧婉婷

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

·中藥工業(yè)·

從何首烏制備高純度二苯乙烯苷的分離純化方法△

李瑤，管淑玉*，李將，王群，鄧婉婷

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：找到一種新的高速逆流色譜溶劑配比體系，以期從何首烏中得到高純度的二苯乙烯苷。方法：以弱堿性條件對(duì)何首烏粗提液初步純化，優(yōu)化弱堿性條件，得到的二苯乙烯苷粗品再用高速逆流色譜來(lái)進(jìn)一步純化。結(jié)果：用優(yōu)化后的弱堿性條件處理得到的二苯乙烯苷粗品，純度達(dá)到96%，用高速逆流色譜進(jìn)一步純化，得到的二苯乙烯苷的純度可達(dá)99%。結(jié)論：這種分離純化二苯乙烯苷的方法充分利用了其在弱堿性條件下較穩(wěn)定的特性，優(yōu)化弱堿性條件能制備出高純度的二苯乙烯苷。這種方法不僅避免了大孔樹(shù)脂等柱色譜分離時(shí)的吸附損失和大量溶劑的消耗，還能彌補(bǔ)二苯乙烯苷因難以通過(guò)結(jié)晶而達(dá)到更高純度的缺憾。本研究提供了一種大量、可重復(fù)制備高純度二苯乙烯苷的途徑。

何首烏；二苯乙烯苷；高速逆流色譜；分離純化；弱堿性

何首烏中的二苯乙烯苷(TSG，全稱(chēng)為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)為白色無(wú)定形粉末，易溶于水、甲醇、乙醇等?，F(xiàn)代藥理研究表明，二苯乙烯苷具有清除自由基[1]、抗衰老[2]以及抑制酪氨酸酶活性等作用[3]。

二苯乙烯苷的分離和純化多采用柱色譜的方法，呂麗爽[4]應(yīng)用聚酰胺柱色譜系統(tǒng)初步純化了何首烏的乙醇粗提液，而后通過(guò)溶劑結(jié)晶技術(shù)，首次分離得到了二苯乙烯苷白色針狀晶體。然而，柱色譜的方法溶劑消耗量大，操作繁瑣，結(jié)晶成功率低。高速逆流色譜(HSCCC)是一種連續(xù)高效的液液分配色譜，基于樣品中各化合物在兩相溶劑之間分配系統(tǒng)的不同來(lái)達(dá)到分離純化的目的。HSCCC消除了固液色譜中由于固相載體帶來(lái)的吸附損失，從而提高了樣品的回收率[5]。HSCCC已被用來(lái)分離何首烏中的二苯乙烯苷。管淑玉等[6]采用HSCCC一步法從何首烏中分離得到了純度達(dá)96%的二苯乙烯苷。二苯乙烯苷在強(qiáng)酸性條件下極不穩(wěn)定，TSG的苷鍵迅速水解；在強(qiáng)堿性條件下TSG易被氧化為醌類(lèi)化合物；在弱堿性條件下，TSG較穩(wěn)定[7]。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)出利用弱堿性條件來(lái)初步純化二苯乙烯苷，再用高速逆流色譜進(jìn)一步純化二苯乙烯苷的方法，避免了柱色譜分離時(shí)的吸附損失和大量溶劑的消耗，為制備高純度的二苯乙烯苷提供了一種新的、簡(jiǎn)單、可行性高的途徑。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TBE300A型高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司)；8823A型紫外檢測(cè)器(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司)；N2000在線(xiàn)色譜工作站、色譜柱(Dikma Technologies)；LC-20A型高效液相色譜儀、UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；RE-52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)；超聲機(jī)(深圳潔康PS-30)。

1.2 材料與試劑

何首烏藥材購(gòu)自于廣州采芝林藥店，由廣東藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThumb.的干燥塊根。2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0844-201103)；乙腈(美國(guó)Crude Company，色譜純，批號(hào)：885900)；蒸餾水(屈臣氏，批號(hào)：20140326)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 藥材提取及前處理方法

2.1.1 藥材提取方法 稱(chēng)取5.0 g何首烏藥材打成粗粉，置于圓底燒瓶中，用75 mL的70%乙醇超聲提取30 min，抽濾，濾渣再加75 mL的70%乙醇超聲提取30 min，抽濾，合并2次濾液，濃縮至5 mL。

2.1.2 粗提液弱堿性處理方法 將上述濃縮液用等量乙酸乙酯多次萃取，照薄層色譜，直至365 nm下水層無(wú)二苯乙烯苷吸收(展開(kāi)劑為乙酸乙酯∶甲醇∶水=20∶2∶1)，合并乙酸乙酯層，蒸干。用10 mL蒸餾水溶解，將其分為5份，分別記為A、B、C、D、E，將A、B、C、D分別用1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH至7.0、8.0、9.0、10.0；樣品E的pH為3.5。將A、B、C、D分別用乙酸乙酯萃取至水層無(wú)二苯乙烯苷吸收，合并乙酸乙酯層，均濃縮至2 mL。將上述萃取濃縮后的樣品按照《中華人民共和國(guó)藥典》所述的方法進(jìn)高效液相色譜儀，測(cè)定二苯乙烯苷的純度和含量，取最優(yōu)pH條件下的二苯乙烯苷粗品，用高速逆流色譜進(jìn)一步純化。

2.2 高速逆流色譜的分離方法

2.2.1 溶劑系統(tǒng)的調(diào)整 將4種溶劑按照比例(正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水=4.5∶50∶0.8∶50)置于分液漏斗中，充分混勻，靜置分層。取等量的上下相置于試管中，加入一定量的何首烏粗提液，振蕩，充分混勻，然后靜置分層。取等量的上下層分別用紫外分光光度儀在320 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算二苯乙烯苷在上下相中的分配系數(shù)K值。分配系數(shù)K=Cs /Cm，其中Cs指溶質(zhì)在固定相中的濃度，Cm指溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度，K值的最佳范圍是0.5～2。

2.2.2 高速逆流色譜的參數(shù)設(shè)置 上層作為固定相，下層作為流動(dòng)相。主機(jī)轉(zhuǎn)速為800 r·min-1，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為1 mL(樣品濃度按生藥計(jì)為1 g·mL-1)，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分。固定相保留率是分離柱中保留的固定相體積與分離柱的柱體積之比，計(jì)算公式如下：

Sf=(Vs/Vc)×100%。

其中，Vs為分離柱中固定相的體積，Vc為分離柱柱體積。

2.3 純度分析和含量測(cè)定

參考《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部“何首烏”項(xiàng)下方法[8]，對(duì)高速逆流色譜儀分離得到的二苯乙烯苷樣品進(jìn)行純度分析和含量測(cè)定。所用色譜柱為Dikma Technologies C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為200～800 nm，全波長(zhǎng)掃描；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)。面積歸一化法計(jì)算純度。

3 結(jié)果與分析

3.1 弱堿性條件pH值的優(yōu)化

粗提液在4個(gè)弱堿性條件下，初步純化后測(cè)得各二苯乙烯苷的純度和含量，見(jiàn)表1。

表1中的數(shù)據(jù)用，SPSS17.0方差分析，算得pH值在8～10之間時(shí)，TSG純度的P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，pH 7時(shí)TSG純度分別與PH 8.0、9.0、10.0時(shí)的TSG純度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4個(gè)pH條件下TSG含量P=0.000<0.01，差異極顯著。綜合考慮TSG純度和得率，選用pH 8.0的條件處理過(guò)的TSG粗品進(jìn)高速逆流色譜。

表1 各PH條件處理后TSG的純度和含量

3.2 溶劑體系K值及固相保留率

逆流色譜儀中，固定相保留率按2.2.2中的公式計(jì)算，值為45.67%。TSG在溶劑體系中上下相的分配系數(shù)K值按照2.2.1中的公式計(jì)算，K值為1.196，在0.5 ～2范圍之內(nèi)。

3.3 高速逆流色譜分離純化結(jié)果

選用pH 8.0條件下處理過(guò)的TSG粗品，用高速逆流色譜進(jìn)一步純化，其HSCCC譜圖見(jiàn)圖1。

取圖1中2號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的餾分，按照2.3中的方法進(jìn)行高效液相色譜鑒別，其液相結(jié)果見(jiàn)圖2。高速逆流色譜分離得到的TSG純品的純度為99.15%，面積歸一化法算得TSG的得率為2.704%。

圖1 TSG粗品高速逆流色譜分離圖

注：A.TSG樣品色譜圖；B.TSG對(duì)照品色譜圖；C.陰性對(duì)照色譜圖。圖2 HSCCC中2號(hào)峰的液相結(jié)果圖

4 討論

4.1 二苯乙烯苷初步純化

何首烏中主要含有多糖、蒽醌、黃酮、酚類(lèi)、二苯乙烯苷類(lèi)等活性成分[9]。本文依據(jù)蒽醌在弱堿性條件下不穩(wěn)定，而TSG在弱堿性條件下穩(wěn)定這一特性，采用弱堿性條件處理，以除去部分蒽醌類(lèi)雜質(zhì)。結(jié)果表明，弱堿性條件下處理何首烏粗提液，可得到純度高達(dá)96%的TSG粗品，這種純化方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，具有進(jìn)一步工藝放大的可能。

4.2 溶劑系統(tǒng)的調(diào)整

本文根據(jù)二苯乙烯苷在上下相中的分配系數(shù)K值對(duì)高速逆流色譜的溶劑體系進(jìn)行調(diào)整。一般來(lái)說(shuō)，K<0.5，出峰太快，峰之間的分離度較差；K>2出峰時(shí)間較長(zhǎng)，峰形變寬，最佳K值應(yīng)在1.0左右[10]。本研究適當(dāng)增大了正己烷的比例，使得上相的疏水性更強(qiáng)，二苯乙烯苷在上相中的溶解度減小。最終測(cè)得的二苯乙烯苷在溶劑體系中的K值為1.196，出峰時(shí)間較合適，分離度較好。本研究中分離純化二苯乙烯苷的方法避免了大孔吸附樹(shù)脂等柱色譜分離時(shí)的吸附損失和大量的溶劑消耗，為制備高純度的二苯乙烯苷提供了一種簡(jiǎn)單可行的途徑。

[1] 周瑩，劉廣鋒，馮娟，等.何首烏3種組分的提取及其清除DPPH自由基作用的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30(3)：301-304.

[2] 苗明三，方曉艷.制何首烏多糖對(duì)衰老模型小鼠抗氧化作用的研究[J].中藥藥理與臨床，2002，18(5)：23-24.

[3] Zequn Jiang，Jimin Xu，Minghai Long，et al.2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside(THSG)induces melanogenesis in B16 cells by MA Pkinase activation and tyrosinase upregulation[J].Life Sciences，2009，85(9)：345-350.

[4] 呂麗爽.何首烏中二苯乙烯苷的制備及抗氧化機(jī)理研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2006.

[5] Oka F，Oka H，Ito Y.Systematic search for suitable two-phase solvent systems for high-speed counter-current chromatograph[J].J.Chromatogr.A，1991，538(1)：99-108.

[6] 管淑玉，彭維，蘇薇薇.高速逆流色譜法一步分離何首烏中的二苯乙烯苷[J].中藥材，2008，31(7)：1079-1080.

[7] 班翊，劉其禮，金悠，等.二苯乙烯苷的穩(wěn)定性研究[J].中草藥，2004(11)：39-41.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：164-165.

[9] 張志國(guó)，呂泰省，姚慶強(qiáng).何首烏的研究進(jìn)展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(1)：62-64.

[10] 曹學(xué)麗.高速逆流色譜分離技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

PurificationofHighPurityStilbeneGlycosidesfromPolygonummultiflorum

LIYao，GUANShuyu*，LIJiang，WANGQun，DENGWanting

(SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangdongPharmacuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective：To find a new system of HSCCC solvent rario for purification of high purity stilbene glycosides fromPolygonummultiflorum.Methods：The crude extract ofP.Multiflorumwas preliminary purified under the optimized weak alkaline.And the crude product of stilbene glycosides has been further purified by HSCCC.Result：The purity of stilbene glycosides crude product reached 96%.The stilbene glycosides further purified by HSCCC reach 99%.Conclusion：The high purity silbene glycoside could be isolated and purified by taking advantage of the stability of stilbene glycosides could under weak alkaline condition.The method could avoid adsorption loss and large solvent consumption in column chromatography like macroporous resin，and non-crystallizable stilbene glycosides，and the method provide a effective way to produce high purity stilbene glycosides in large scale.

Polygonum multiflorum；stilbene glycosides；HSCCC；purification；weakly alkaline

2014-07-12)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81001702)；省部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2010B090400519)；廣東藥學(xué)院人才啟動(dòng)基金(2007ZYX01)；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(1057312033)

*

管淑玉，副教授，研究方向：抗炎抑菌及色素調(diào)節(jié)活性物質(zhì)研究；Tel：(020)39352177，Email：guanshy3@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.020