李彤彤，金燕清，王秋玲，王文全，，3*，侯俊玲*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

·中藥農(nóng)業(yè)·

牛蒡子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究△

李彤彤1，金燕清1，王秋玲2，王文全1，2，3*，侯俊玲1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102)

目的：研究牛蒡種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法，為牛蒡種子質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)程及質(zhì)量分級(jí)的制定提供依據(jù)。方法：參照中國《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》對(duì)牛蒡種子的扦樣、凈度分析、真實(shí)性鑒定、千粒重、含水量、發(fā)芽率、生活力等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果與結(jié)論：通過對(duì)牛蒡種子7項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，初步建立了牛蒡種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法。

牛蒡子；種子；質(zhì)量檢驗(yàn)方法

牛蒡ArctiumlappaL.為菊科植物，其干燥成熟的果實(shí)入藥，稱為牛蒡子，是我國臨床常用中藥，具有疏散風(fēng)熱，宣肺透疹，解毒利咽的功效；用于風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風(fēng)疹、咽喉腫痛、痄腮丹毒、癰腫瘡毒的病癥[1]。目前我國牛蒡子藥材主要來源于東北野生和西北栽培品，隨著野生資源的日益匱乏，以及人工采收野生資源成本的增加，人工栽培牛蒡子已成為趨勢(shì)。然而商品牛蒡種子質(zhì)量參差不齊，其優(yōu)劣直接影響藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量；且目前尚缺乏質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，無法對(duì)市場(chǎng)流通種子進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)和規(guī)范。本文為制定牛蒡種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

牛蒡種子于2013年9月分別收集于甘肅省定西市渭源縣會(huì)川鎮(zhèn)(WY)，甘肅省岷縣當(dāng)歸城(MX)陜西省南縣合陽市(HY)栽培牛蒡子產(chǎn)地，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所王文全教授鑒定為牛蒡A.lappa的種子。

2 方法

2.1 扦樣

2.1.1 種子批 根據(jù)牛蒡種子的市場(chǎng)流通情況和單次可能的交易量及凈度分析試驗(yàn)樣品不少于2500粒種子，送驗(yàn)樣品為試驗(yàn)樣品10倍量確定牛蒡種子批的最大質(zhì)量和樣品最小質(zhì)量。

2.1.2 扦取送驗(yàn)樣品和試驗(yàn)樣品 按GB/T3543.2——“農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”扦樣執(zhí)行。

2.2 種子凈度分析

按GB/T3543.3——“農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”凈度分析執(zhí)行。在不損傷發(fā)芽力的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢查，直接挑選純凈種子。

2.3 種子真實(shí)性鑒定

觀察測(cè)量種子形態(tài)、大小、表面特征和種子顏色，采用種子外觀形態(tài)法，隨機(jī)數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，逐粒觀察牛蒡種子形態(tài)特征，并與標(biāo)準(zhǔn)種子樣品或鑒定圖片和有關(guān)資料對(duì)照，同時(shí)做好記錄。

2.4 千粒重測(cè)定

分別考察百粒法、五百粒法及千粒法。①百粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取100粒，重復(fù)8次，分別記錄百粒重，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)；②五百粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取500粒，重復(fù)3次，分別記錄五百粒重，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)；③千粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取1000粒，重復(fù)2次，分別記錄千粒重，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

2.5 發(fā)芽率測(cè)定

2.5.1 發(fā)芽前種子的處理 將牛蒡種子在水中浸泡12 h后，用0.2%高錳酸鉀溶液消毒20 min，用清水沖洗5次用于置種。

2.5.2 適宜發(fā)芽床的確定 發(fā)芽床試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：①在發(fā)芽盒中鋪3層濕潤的濾紙，然后置種；②在發(fā)芽盒中鋪3層濕潤的紗布，然后置種；③發(fā)芽盒中鋪4 cm厚0.05～0.8 mm的濕細(xì)砂(砂水比為4∶1)，然后置種。培養(yǎng)條件為25 ℃光照培養(yǎng)。每個(gè)處理300粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。

2.5.3 適宜發(fā)芽溫度的確定 將沖洗過的種子置于發(fā)芽床上(濾紙上)，于20 ℃、25 ℃、30 ℃中培養(yǎng)，每個(gè)溫度3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒。每天記錄、觀察發(fā)芽情況，注意保持培養(yǎng)皿內(nèi)水分。

2.5.4 發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間的確定 根據(jù)種子發(fā)芽表現(xiàn)，確定初次計(jì)數(shù)和末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以胚根伸出種皮2 mm時(shí)的天數(shù)為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以種子萌發(fā)數(shù)達(dá)到最高時(shí)，以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。

2.5.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 發(fā)芽率以發(fā)芽終期的全部正常發(fā)芽種子粒數(shù)占供檢種子粒數(shù)的百分率表示。發(fā)芽指數(shù)(GI)以下列公式進(jìn)行計(jì)算：GI=Σ(Gt/Dt)。式中，Gt為在t日后的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。采用 Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.6 含水量測(cè)定

參照GB/T3543.6——“農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程”水分測(cè)定執(zhí)行。用小型粉碎機(jī)將種子粉碎約15 s。分別考察高溫烘干法和低恒溫烘干法對(duì)種子含水量進(jìn)行測(cè)定。① 高溫烘干法：分別在(133±2)℃高溫條件下，設(shè)置1、2、3、4 h計(jì)算種子水分損失量；②低恒溫烘干法：分別在(105±2) ℃低恒溫條件下，設(shè)置5、10、15、20 h計(jì)算種子水分損失量。以上試驗(yàn)每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)(5±0.001) g。

2.7 生活力測(cè)定

2.7.1 染色的試驗(yàn)條件確定

2.7.1.1 種子處理和種子胚的暴露方法 預(yù)處理：將種子在室溫下直接泡于自來水中。牛蒡種子如果時(shí)間浸泡太長，組織會(huì)腐爛，故浸泡時(shí)間為12 h。

種子胚的暴露方法：牛蒡種子則縱向二分之一處切成兩半。

2.7.1.2 染色時(shí)間、濃度和溫度 采用3因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。四唑染色時(shí)間為1、3、5 h濃度設(shè)0.1、0.3、0.5%，置于25，30，35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每個(gè)處理300粒種子，3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。染色結(jié)束后，瀝去溶液，用清水沖洗3次，將裸種子擺在培養(yǎng)皿中，逐一檢查，子葉和胚完全染成紅色的表示有生活力的種子。

2.7.2 有無生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)的確定 參照種子的發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果，擬定出有生活力種子中允許出現(xiàn)的不染色、軟弱或壞死組織的最大面積，建立牛蒡種子四唑活力染色的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

經(jīng)分析種子批的最大質(zhì)量為2000 kg，送驗(yàn)樣品最少為300 g，凈度分析試樣最少為30 g。

3.2 凈度分析

3份牛蒡種子試樣均沒有其他植物種子，所以本次檢驗(yàn)記錄這一項(xiàng)為零。使用此方法作凈度分析，各試樣增失差距均沒有偏離原始質(zhì)量的 5%，所以此方法和程序切實(shí)可行，見表 1。

表1 不同產(chǎn)地牛蒡種子凈度測(cè)定

3.3 真實(shí)性鑒定

種子真實(shí)性鑒定結(jié)果如下：瘦果長倒卵形，兩端平截，略扁彎曲，長5～7 mm，直徑2～3 mm。表面灰褐色或淡灰褐色，具多數(shù)細(xì)小黑斑，并具有明顯的縱棱線。先端較寬，有一圓環(huán)，中心有點(diǎn)狀凸起的花樣殘跡；基部狹窄，有圓形果柄痕。無臭；種子氣特異，味苦微辛，稍久有麻舌感。千粒重一般為9～12 g。

3.4 千粒重測(cè)定

千粒重結(jié)果見表2，各處理間變異系數(shù)均小于4.0%，而千粒法測(cè)定變異系數(shù)最小，平均為0.69。對(duì)3方法測(cè)定的千粒重值進(jìn)行多重比較，有顯著差異(P<0.05)。綜合比較3方法，選擇千粒法作為牛蒡種子千粒重的測(cè)定方法。

表2 牛蒡種子不同千粒重測(cè)定方法比較

3.5 發(fā)芽率測(cè)定

3.5.1 發(fā)芽前種子的處理 將牛蒡種子在水中浸泡12 h后，用0.2%高錳酸鉀溶液消毒20 min，用清水沖洗5次用于置種。

3.5.2發(fā)芽床的確定 通過比較 3個(gè)產(chǎn)地牛蒡種子在不同發(fā)芽床上的發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)，采用濾紙床時(shí)，無論從發(fā)芽率還是發(fā)芽指數(shù)都較優(yōu)于紗布床和砂土床，且有顯著差異(P<0.05)，故選擇濾紙床為牛蒡種子發(fā)芽床，見表3。

表3 不同發(fā)芽床間牛蒡種子發(fā)芽情況比較

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取α=0.05水平，同一列中含有不同字母者為差異顯著，下表同。

3.5.3 發(fā)芽溫度的確定 不同發(fā)芽溫度下，牛蒡種子發(fā)芽率表現(xiàn)出一定的差異。通過比較3個(gè)產(chǎn)地牛蒡種子在不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，結(jié)果表明(見表4)：當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)都較高，和其他溫度比較差異顯著(P<0.05)。故選擇25 ℃作為牛蒡種子發(fā)芽溫度。

表4 不同發(fā)芽溫度下牛蒡種子發(fā)芽情況比較

3.5.4 發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間的確定 吸脹后的牛蒡種子發(fā)芽速度很快，置發(fā)芽床后第2 d胚根迅速露出種皮，第6 d以后發(fā)芽速度明顯下降，并趨于平緩，第8 d后很少有再發(fā)芽情況，見圖 1。所以，整個(gè)發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間在第 2～8 d。第 2 d可作為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，第8d可作為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。

圖1 牛蒡種子發(fā)芽率與發(fā)芽時(shí)間的關(guān)系

3.6 含水量測(cè)定

牛蒡種子在高溫下烘干4 h 后，失水量基本保持穩(wěn)定，并且在4～5 h失水量無顯著差異。此后數(shù)小時(shí)重量不變，綜合2個(gè)產(chǎn)地種子情況，選擇烘干時(shí)間4 h為宜；在低恒溫烘干后15 h內(nèi)失水量差異不顯著。15～20 h差異性顯著，20 h后失水量幾乎不變，重量基本恒定，綜合2個(gè)產(chǎn)地種子情況，選擇烘干時(shí)間20 h為宜，見表5。同時(shí)，對(duì)高溫烘干4時(shí)和低溫烘干20 h間測(cè)定牛蒡種子含水量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2種烘干方法間測(cè)定值差異不顯著。鑒于低恒溫烘干法所需時(shí)間較長，所以選擇高溫烘干4 h為宜。

表5 不同烘干時(shí)間下牛蒡種子失水量變化

3.7 生活力測(cè)定

3.7.1 染色試驗(yàn)條件的確定 由表6可知，牛蒡種子染色情況與染色的時(shí)間、濃度、溫度均有密切聯(lián)系。試驗(yàn)結(jié)果表明，處理5，9染色情況較好，著色率都在90%以上。但由于四唑有毒性，從染色時(shí)間和濃度綜合考慮，選擇處理5，即染色3 h，0.4%四唑濃度，35 ℃作為牛蒡種子生活力檢測(cè)的染色條件為宜。

3.7.2 有無生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)的確定 有活力的牛蒡種子被染成有光亮的紅色，且染色均勻。符合下列任意一條的列為有生活力種子：①胚完全著色；②子葉端小于1/3不染色，其余全部染色。無生活力的種子染色情況：①胚完全不著色；②胚根不染色。

表6 四唑不同處理對(duì)牛蒡種子染色著色率的影響

本研究從扦樣、凈度分析、真實(shí)性鑒定、千粒重、發(fā)芽率、含水量及生活力7方面對(duì)甘草種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法進(jìn)行研究，確定適宜甘草種子質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)方法，見表7。

表7 牛蒡種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法

4 討論

不同產(chǎn)地牛蒡種子有一定差異，在進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)方法建立時(shí)需考慮種子材料的代表性。本研究試驗(yàn)用種取自牛蒡種子 3個(gè)主產(chǎn)地，能較好的代表生產(chǎn)上牛蒡用種的質(zhì)量[2]。

在牛蒡種子生活力快速檢測(cè)過程中，曾應(yīng)用溴麝香草酚蘭(BTB)法，但 BTB 瓊脂制作麻煩、冷凝時(shí)間快，是否染色不容易觀察，規(guī)律性不強(qiáng)，不能準(zhǔn)確反映種子的生活力狀況。由實(shí)驗(yàn)分析可知，四唑染色法測(cè)定的牛蒡種子生活力是真實(shí)的，并且與發(fā)芽率存在極大的相關(guān)性。

種子的優(yōu)劣是保障中藥材種植后能否獲得穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)和達(dá)到國家法定部門規(guī)定可控指標(biāo)的關(guān)鍵，特別是純天然、無公害的中藥材生產(chǎn)，更離不開種子的質(zhì)量監(jiān)控[3]。目前，在發(fā)達(dá)國家種子質(zhì)量評(píng)價(jià)中，對(duì)種子健康度、種子活力和品種純度檢驗(yàn)的要求日益增多[4]。但我國目前尚不具備全面開展健康檢驗(yàn)的條件，同時(shí)大多數(shù)中藥材種源混雜，沒有品種之分，使得這些方面檢測(cè)指標(biāo)推廣受到限制[3]。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].中國醫(yī)藥科技出版社，2010：66.

[2] 于福來，王文全，方玉強(qiáng)，等.甘草種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究[J].中國中藥雜志，2011，36(6)：746.

[3] 陳君，楊世林.不同來源黃芩種子的質(zhì)量比較[J].中藥材，2002，25(9)：617.

[4] 淡紅梅，祁建軍，周麗莉，等.丹參種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的研究[J].中國中藥雜志，2008，33(17)：2093.

StudyontheMethodofQualityTestfortheSeedofFructusarctii

LITongtong1，JINYanqing1，WANGQiuling2，WANGWenquan1，2，3*，HOUJunling1*

(1.SchoolofChinesePharmacy，BeijinguniversityofChinesemedicine，Beijing100102，China；2.InstituteofMedicinalPlants，ChineseAcademyofMedicalSciences，Pekingunionmedicalcollege，Beijing100193，China；3.EngineeringResearchCenterofGAPforChineseCrudeDrugs，MinistryofEducation，Beijing100102，China)

Objective：The aim of this study was to optimize the testing methods for seed quality，and to provide a basis for establishing seed testing rules and quality grading standard ofArctiumlappa.Methods：The effect of pre-treatment methods，illumination condition，germination bed and culture temperature on the germination ofA.lappa.seeds was compared.ResultsandConclusion：The seed testing methods for quality items ofA.lappahad been initially established.

Arctiumlappa；seed；quality testing methods

2014-11-27)

國家“中藥材種子種苗和種植(養(yǎng)殖)標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái)”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09304006)

*

王文全，教授，研究方向：中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及其產(chǎn)品開發(fā)；Tel：(010)84738334，Email：wwq57@126.com； 侯俊玲，教授，研究方向：中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)；Tel：(010)84738334，E-mail：mshjl@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.018