徐鳴曙,陳春艷,李昌植,葛林寶,張淑靜,趙丹,李明哲,韓清,張英杰

(1.上海市針灸經絡研究所,上海 200030;2.上海市氣功研究所,上海 200030;3.上海中醫(yī)藥大學,上海 201203)

自Globus首先證實多巴胺(dopamine,DA)在缺血性腦損傷中的作用以來,人們便對DA在缺血性腦損傷中的作用機制進行了廣泛而深入的研究。腦內微透析發(fā)現,腦缺血時可引起紋狀體、海馬等部位DA和興奮性氨基酸(exicted amine acid,EAA)的大量堆積[1]。在腦缺血再灌注過程中DA自身的神經毒性、代謝產物的神經毒性、增強EAA的毒性以及誘導凋亡等作用[2-4]在腦缺血再灌注損傷中具有重要作用。多巴胺轉運體(dopamine transport,DAT)在維持突觸間DA適當濃度中發(fā)揮重要作用,而多巴胺D1受體(D1R)和D2R是其發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)之一。本實驗采用大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,觀察電針、D1R工具藥及針藥結合對腦缺血再灌注大鼠紋狀體內D1R和DAT表達的影響,以期探討電針干預對缺血性腦損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康雄性Sprague Dawley大鼠47只,體重(300±20)g,實驗大鼠均購自中科院上海實驗動物中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級實驗室飼養(yǎng),溫度 20～25℃,濕度 40%～70%,噪聲＜60 dB,換氣次數 10～20次/h,工作照度12 h明12 h暗,實驗前適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2 主要試劑

多巴胺D1受體激動劑(SKF38393,Sigma公司,批號065K4615);多巴胺D1受體拮抗劑(SCH23390,Sigma公司,批號015K4630);D1R多克隆抗體(兔抗鼠)(Santa Cruz公司,批號SC-14001);DAT多克隆抗體(兔抗鼠)(Santa Cruz公司,批號SC-14002);EnVision kit(DAKO公司,批號GK500705)。

1.3 主要儀器

環(huán)球牌針灸針(蘇州針灸用品廠),0.30 mm×13 mm;G6805-ⅠA型電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器廠)。

1.4 模型制作

參照Longa EZ[5]的方法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。

1.5 動物分組

按隨機分組原則將SD雄性大鼠分為空白組、模型組、電針組、激動劑組、電針＋激動劑組、拮抗劑組、電針＋拮抗劑組。空白組5只,其余各組均7只。

1.6 動物處理

空白組:正常對照組。

模型組:成功制備線栓法大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)再灌注模型。

電針組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予電針治療,取雙側風池穴,選連續(xù)波,頻率2 Hz,強度以大鼠耳廓輕度抖動為度(約 3 mA,示波器檢測),共2次,每次25 min,間隔10 min。

激動劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予1 mg/kg的劑量予腹腔注射SKF38393。

電針＋激動劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予電針治療＋腹腔注射SKF38393。

拮抗劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予1 mg/kg的劑量予腹腔注射SCH23390。

電針＋拮抗劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予電針治療＋腹腔注射SCH23390。

1.7 神經功能缺損評分

各組處死前(再灌225 min)進行神經功能評分[6]。

1.8 指標檢測

1.8.1 取材

實驗結束時用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉動物,經心臟灌注,先用 36℃的生理鹽水(大約250 mL),再用室溫的4%多聚甲醛400～500 mL,至大鼠四肢僵硬皮膚蒼白為度。斷頭取腦,腦組織置于 4%多聚甲醛后固定6～8 h,然后浸于20%蔗糖中至沉底,4℃保存7 d后剝離紋狀體(主要是尾狀核)備用。

1.8.2 免疫組化檢測

參照試劑盒說明書進行免疫組化實驗。

1.8.3 觀察方法

用已知陽性標本作陽性對照,陰性對照用PBS代替一抗,陽性產物為棕黃色或棕褐色,圖像分析用MOTIC數碼醫(yī)學細胞圖像分析系統(tǒng)。選取5個染色明顯的視野(×400)計數檢測指標的陽性表達面積光密度,組間進行比較。

1.9 數據處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,所有結果以均數±標準差表示,各組用單因素方差分析,組間兩兩比較用N-S-K法進行檢驗。

2 結果

2.1 各組神經功能缺損評分比較

由表1可見,電針組與模型組比較,神經功能缺損評分均顯著降低(P＜0.05);激動劑組、電針＋激動劑組分別與電針組比較,神經功能缺損評分均顯著升高(P＜0.05);激動劑組、電針＋激動劑組分別與電針＋拮抗劑組比較,神經功能缺損評分均顯著升高(P＜0.05);其余各組間比較有差異,但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組神經功能缺損評分、D1R積分光密度、DAT積分光密度比較 (x±s)

2.2 各組D1R積分光密度比較

由表1可見,拮抗劑組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而其他各組與空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。電針組、拮抗劑組、電針＋拮抗劑組與模型組比較,D1R積分光密度有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。激動劑組與電針＋激動劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),且這兩組D1R積分光密度與模型組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。電針組D1R積分光密度與電針＋拮抗劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但這兩組與拮抗劑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組DAT積分光密度比較

由表1可見,各組DAT表達與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但除模型組外各組間比較有差異,但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

腦血管疾病是危害人類生命與健康的主要疾病之一,其中80%以上系由腦部缺血造成。針刺治療中風有效,但具體作用機制尚未闡明。多巴胺是腦內重要的神經遞質,與缺血性腦損傷關系密切[7-8]。DR和DAT是分別位于突觸后膜和突觸前膜上的DA特異性受體和轉運體,二者共同作用保持了DA胞內外相對平衡,及其功能發(fā)揮。此外,D1R通過AC/cAMP/PKA通路、MAPK通路等信號途徑,調控細胞內Ca2﹢水平、K﹢通道和Na﹢/K﹢-ATP酶活性,參與調節(jié)細胞內外Na﹢、K﹢、Ca2﹢等離子平衡[9-10]。

本研究主要集中于D1R和DAT,研究顯示造模后大鼠神經功能缺損評分明顯增高,并伴隨 D1R表達的顯著升高,與空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義。電針處理可明顯下調 D1R的表達,同時減輕神經功能缺損的評分。提示電針可能通過調節(jié)D1R的表達而間接調節(jié)腦缺血再灌注過程中細胞內Ca2﹢水平、K﹢通道、Na﹢/K﹢-ATP酶的活性、突觸后膜KA/NMDA受體對Glu敏感性等,并最終使腦組織得到保護。

在電針基礎上加用激動劑可使電針效應完全消除,顯示激動劑可阻斷電針的腦保護作用。單純使用激動劑,不予電針,其結果與模型組相似,之間差異無統(tǒng)計學意義。該結果提示,該D1R激動劑無明顯腦保護作用;缺血 90 min所造成的損傷已接近相對最嚴重的程度,D1R激動劑很難進一步加重損傷;若缺血損傷較輕時,加用D1R激動劑,就可能表現出加重損傷的效應。

綜合神經功能缺損評分的結果進行分析,顯示電針組恢復作用明顯,D1R表達也明顯下調;加用拮抗劑,未使神經保護的效應進一步增強;而單獨使用拮抗劑,對神經功能缺損有明顯保護作用,但與電針組尚略有差距,然而其D1R下調至正常水平。該結果從側面反映,即使D1R恢復至正常水平,神經功能缺損依然存在。電針+拮抗劑組雖然D1R明顯恢復,但未至正常水平,然而其神經功能恢復與電針組相當。該結果提示,電針與D1R的效應不重合,D1R不是電針效應的唯一途徑;D1R在腦損傷修復中并非越少越好,應維持一定量。

綜合行為學觀察及D1R激動劑、拮抗劑的結果,分析后可以得知,在缺血再灌注腦損傷及保護中,除D1R外尚有其他因素的參與,故D1R的作用雖較重要,但也較有限;電針發(fā)揮的調節(jié)作用不能等同于D1R的作用,電針和D1R的效應不能做簡單的疊加,調節(jié)D1R通路只是電針發(fā)揮其作用的途徑之一。

從本實驗DAT表達結果來看,雖然模型組與各組間比較差異有統(tǒng)計學意義,但除模型組外各組間差異無統(tǒng)計學意義,說明電針、工具藥等干預方法可能對腦缺血再灌注條件下DAT的表達無影響,即DAT的表達與D1R介導和電針調節(jié)關系甚微,但此假設尚待進一步驗證。

[1] Ishige K, Chen Q, Sagara Y, et al. The activation of dopamine D4 receptors inhibits oxidative stress-induced nerve cell death[J]. J Neurosci, 2001,21(16):6069-6076.

[2] Yurko-Mauro KA, Friedman E. Dopamine-stimulated changes in activated calpain I in rat hippocampal slices[J]. J Neurosci Res, 1996,43(4):476-481.

[3] Werling LL, Jacocks HM 3rd, Rosenthal RE, et al. Dopamine release from canine striatum following global cerebral ischemia/reperfusion[J]. Brain Res, 1993,606(1):99-105.

[4] Hattori A, Luo Y, Umegaki H, et al. Intrastriatal injection of dopamine results in DNA damage and apoptosis in rats[J]. Neuroreport, 1998,9(11):2569-2572.

[5] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[6] Zhang YG, Liu TP, Qian ZY, et al. Influence of total saponins of Panax ginseng on infarct size and polyamine contents in rat brain after middle cerebral artery occlusion[J]. Chinese J Pharmacol Toxicol,1994,8(4):250-255.

[7] Xu MS, Fang C, Xu J, et al. Dynamic changes of dopamine and its metabolite levels in the rat striatum after cerebral ischemiareperfusion and electroacupuncture[J]. Zhen Ci Yan Jiu, 2009,34(4):230-235.

[8] Richards DA, Obrenovitch TP, Symon L, et al. Extracellular dopamine and serotonin in the rats triatum during transient ischemia of differents eveities: a microdialysis study[J]. J Neurochem, 1993,60(1):128-136.

[9] Lee MY, Heo JS, Han HJ. Dopamine regulates cell cycle regulatory proteins via cAMP, Ca(2﹢)/PKC, MAPKs, and NF-kappaB in mouse embryonic stem cells[J]. J Cell Physiol, 2006,208(2):399-406.

[10] Yagishita S, Hayashi-Takagi A, Ellis-Davies GC, et al. A critical time window for dopamine actions on the structural plasticity of dendritic spines[J]. Science, 2014,345(6204):1616-1620.