宋基正，李凌軍，孫　鵬，王　朋

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院山東濟(jì)南250355）

·基礎(chǔ)研究·

丹參總酚酸抑制酪氨酸酶機(jī)理研究

宋基正，李凌軍，孫鵬，王朋

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院山東濟(jì)南250355）

目的：研究丹參總酚酸、總丹參酮對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理。方法：采用紫外-可見分光光度法測定490nm處酪氨酸酶催化產(chǎn)生的多巴醌的吸光度，并通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算酪氨酸酶的Km和Vm值，考察丹參總酚酸、總丹參酮對酪氨酸酶的抑制作用及作用機(jī)理。結(jié)果：酪氨酸酶的Km=0.2067mg·ml-1，Vm= 0.0222·min-1，總丹參酮在濃度為2mg·ml-1抑制率為0.00%，丹參總酚酸濃度達(dá)到10mg·ml-1后Km變大，Vm變小。結(jié)論：總丹參酮對酪氨酸酶無抑制作用；丹參總酚酸對酪氨酸酶具有可逆抑制作用，抑制類型屬于混合I型。

丹參；酪氨酸酶；總丹參酮；總丹酚酸；紫外-可見分光光度法

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰的功效［1］?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為丹參具有保護(hù)皮膚，擴(kuò)張血管、抗血栓形成、改善皮膚微循環(huán)、改善皮膚顏色、調(diào)節(jié)組織修復(fù)與抑菌等藥理作用［2］，丹參所含的酚酸類成分如丹參素、原兒茶醛等具有抑制酪氨酸酶的活性。丹參的水溶性提取物丹參總酚酸具有獨(dú)特宜人的天然清香氣，是美容護(hù)膚用品的理想天然原料。

目前臨床采用丹參注射液穴位注射配合中藥湯劑治療黃褐斑等色素沉積具有很好的療效［3］。丹參在復(fù)方中使用同樣具有良好的美白效果。將含有丹參的中藥美白面膜通過超聲波導(dǎo)入皮膚，治療炎癥引起的色素沉著，療效達(dá)到90%［4］。美白驗(yàn)方祛斑方中含有丹參，張理梅等發(fā)現(xiàn)祛斑方能使黑色素陽性細(xì)胞數(shù)量明顯下降［5］。

目前國內(nèi)外的研究顯示，丹參在化妝品中的應(yīng)用前景良好。但是丹參對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理尚無研究。本文通過測定酪氨酸酶的米氏常數(shù)Km、最大反應(yīng)速率Vmax，研究丹參總酚酸對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理。

1　儀器和材料

1.1儀器

Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司），LDZ4-0.8離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技有限公司），DZKW-D-4型電熱恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司），UV-5500型紫外-可見分光光度儀（上海元析儀器有限公司）。

1.2藥品

酪氨酸酶（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：34B14750），左旋多巴（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號：B150255），PBS緩沖溶液（自配，A液每1L含NaH2PO4·2H2O 7.80g，B液每1L含Na2HPO4·12H2O 17.80g），磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉為分析純，水為超純水，丹參藥材（購自濟(jì)南建聯(lián)大藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李保國副教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge）。

2　方法和結(jié)果

2.1丹參酮、丹參總酚酸制備

丹參加11倍量水，浸泡30min，80℃水浴回流提取2次，第一次提取2h，第二次提取1.5h，合并濾液，60℃減壓濃縮至相對密度1.18～1.22，放冷，加乙醇使含醇量達(dá)到70%，4℃靜置12h，虹吸上清液，減壓回收乙醇，至稠膏狀，干燥，即得丹參總酚酸提取物［1，6］。

丹參加8倍量90%乙醇，80℃回流提取2次，每次1h。濾過，合并濾液，60℃減壓回收乙醇并濃縮至相對密度1.30～1.35，用熱水洗至洗液無色，干燥，即得總丹參酮提取物［1，7］。

2.2供試液配制

2.2.1PBS緩沖液配制：精密稱取磷酸二氫鈉7.80g，用超純水定容至1L，為A液。精密稱取磷酸氫二鈉17.80g，用超純水定容至1L，為B液。121℃熱壓滅菌30min，使用時(shí)取等體積的A，B液體混合均勻，即得ph=6.8的PBS緩沖液。

2.2.2酶溶液配制：精密稱取酪氨酸酶4.60mg，用PBS緩沖液定容至10ml，搖勻，精密移取400μl，用PBS定容至10ml，即得濃度為0.0184mg·ml-1的酶溶液。

2.2.3左旋多巴溶液配制：精密稱取左旋多巴70.3mg，用PBS緩沖液定容至100ml，搖勻，超聲10min，濾過，即得濃度為0.703mg·ml-1的左旋多巴溶液。

2.2.4丹參總酚酸溶液配制：取丹參總酚酸提取物約10g，精密稱定，用PBS緩沖液定容至100ml，搖勻，超聲10min，3 000r·min-1離心10min，取上清液，用0.22μm微孔濾膜過濾，即得濃度為100mg·ml-1丹參總酚酸溶液。

2.3總丹參酮、丹參總酚酸對酪氨酸酶的抑制效果

取丹參總酚酸提取物約100mg，精密稱定，用PBS緩沖溶液溶解，并定容至10ml。取總丹參酮提取物約20mg，精密稱定，用1%吐溫-80PBS緩沖液定容至10ml。用96孔板進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)方法見表1。

按表1加完試液后30℃反應(yīng)10min，加入左旋多巴溶液200μl，30℃反應(yīng)10min，用酶標(biāo)儀測定吸光度，每組6個(gè)平行孔，求每組吸光度差值ΔA并計(jì)算平均值，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)（雙側(cè)），用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，并計(jì)算抑制率，抑制率公式為：抑制率=（1-加藥組/空白組）×100%。結(jié)果見表2，丹參總酚酸組與空白對照組對比具有顯著性差異（P＜0.05），總丹參酮組無顯著性差異（P＞0.05），丹參總酚酸提取物對酪氨酸酶的的抑制率為28.57%，總丹參酮提取物對酪氨酸酶的抑制率為0.00%。

表1　分組及實(shí)驗(yàn)溶液加入方法

表2　總丹參酮、丹參總酚酸抑制酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4丹參總酚酸對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理

2.4.1酪氨酸酶的Km和Vmax測定：分別精密移取左旋多巴溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml，用PBS緩沖液定容至10ml。A組為空白對照組，B組為實(shí)驗(yàn)組。A1到A10加入等體積不同濃度的左旋多巴溶液，B組按序號對應(yīng)，加入與A組相同的左旋多巴溶液，按表3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。30℃反應(yīng)10min，用紫外-可見分光光度計(jì)測定490nm波長處的吸光度A。反應(yīng)速度v=A/t，以底物濃度［S］為橫坐標(biāo)，以吸光度變化速率v為縱坐標(biāo)，繪制v-［S］曲線，見圖1，Km值在0.2mg·ml-1附近。

表3　酪氨酸酶的酶學(xué)常數(shù)測定方法

圖1　v-［S］曲線圖

根據(jù)酶學(xué)知識，底物濃度在0.3Km至2.0Km范圍內(nèi)為合理濃度。因此選擇0.0703，0.1406，0.2109，0.2812，0.3515mg·ml-1的5組數(shù)據(jù)帶入Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程，得方程1/v=-9.311/［S］+45.045，（r= 0.9992），由方程可求出Km=0.2067，Vm=0.0222·min-1。

2.4.2丹參總酚酸對酪氨酸酶可逆抑制研究：根據(jù)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)［8］，固定底物左旋多巴的量，改變酶量，測定不同濃度丹參總酚酸對酪氨酸酶催化速率的影響，在96孔板中加入酪氨酸酶溶液50，60，70，80，90μl，用PBS緩沖液補(bǔ)加至150μl?？瞻捉M設(shè)為A加100μl的PBS緩沖液，實(shí)驗(yàn)組設(shè)為B、C、D、E加100μl不同濃度丹參總酚酸溶液，30℃反應(yīng)10min，然后加入100μl的左旋多巴溶液，30℃反應(yīng)10min，立即測定吸光度值。不同酶濃度做3個(gè)平行孔，求均值。以吸光度變化速率為縱坐標(biāo)，酶量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果，隨著丹參總酚酸濃度的增大，直線的斜率降低，見表4。

2.4.3可逆抑制作用類型考察：采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來判斷抑制作用類型［9］，固定加酶量，改變測定體系中底物左旋多巴量和丹參總酚酸的濃度。精密移取2.2.3項(xiàng)下左旋多巴溶液2、4、6ml，用PBS緩沖液定容至10ml。精密移取2.2.4項(xiàng)下丹參總酚酸溶液0.5、1.0、1.5、2.0ml，用PBS緩沖液定容至10ml。在96孔板上每孔加入50μl酪氨酸酶溶液，同列加入100μl相同濃度的丹參總酚酸溶液，且丹參總酚酸濃度由左向右遞增，最左側(cè)設(shè)置空白對照孔，加100μl的PBS緩沖溶液，30℃反應(yīng)10min，所有孔均加入200μl的L-DOPA溶液，30℃反應(yīng)10min，用酶標(biāo)儀測定吸光度。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/v為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。線性方程見表5。

3　討論

皮膚顏色不佳的確切原因及機(jī)制目前尚不清楚，一般認(rèn)為其主要與內(nèi)分泌失調(diào)、紫外線照射等因素有關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，皮膚內(nèi)黑色素的生成和排泄呈動態(tài)平衡。暗黃的皮膚大多由于黑色素生成大于排泄，皮膚中黑色素的不斷累積。酪氨酸酶是調(diào)控人體黑素色產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，因此，美白的關(guān)鍵點(diǎn)是抑制酪氨酸酶的活性。改善膚色令皮膚煥發(fā)出自然光彩有兩個(gè)著力點(diǎn)，一減少黑色素生成，二加快黑色素清除。丹參總酚酸能夠抑制黑色素的生成；同時(shí)，丹參通過改善微循環(huán)可以加快黑色素清除。從兩個(gè)方面幫助皮膚重新恢復(fù)動態(tài)平衡。

表5　不同濃度丹參總酚酸Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程

在實(shí)驗(yàn)中隨著丹參總酚酸濃度的增大，直線的斜率降低，如表4所示，說明丹參總酚酸對酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過程。丹參總酚酸通過降低酪氨酸酶的催化效率而導(dǎo)致酶活力下降，不是減少有效酶量而引起酶活力下降。因此丹參美白基本不存在不可逆轉(zhuǎn)的副作用，如有不適停止使用可恢復(fù)。

表4　丹參總酚酸濃度與線性方程關(guān)系表

丹參總酚酸濃度超過10mg·ml-1后，米氏常數(shù)Km變大，最大反應(yīng)速度Vmax變小，如表5所示，因此抑制機(jī)理為混合I型。闡明抑制機(jī)理可以使丹參美白產(chǎn)品的制造和使用有據(jù)可依，也為丹參藥妝的研究提供理論基礎(chǔ)。

總丹參酮對酪氨酸酶沒有抑制作用，而且對皮膚有很強(qiáng)的色素附著，難以洗除，因此，美白產(chǎn)品中不宜添加總丹參酮。

綜上所述，丹參美白的有效部位是丹參總酚酸。因此，丹參作為美白化妝品原料時(shí)，應(yīng)該使用水作為提取溶劑，這既有利于提取有效成分，也更加經(jīng)濟(jì)。這對于實(shí)際生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

21世紀(jì)多學(xué)科交叉發(fā)展，使國際高端化妝品研究走向多層次、整體化。本文將醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、美容學(xué)相互融合提出了中藥美白化妝品研制的新思路。醫(yī)學(xué)與美容學(xué)結(jié)合，可以使美容學(xué)更安全，更完善。中藥學(xué)與美容學(xué)結(jié)合，可以生產(chǎn)出功能性化妝品。本文研究丹參總酚酸對酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理，從酶學(xué)層面闡釋了丹參用于美白的可能性，為丹參美白護(hù)膚品的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。不僅如此，在后續(xù)研究中還可以將本文中的方法作為一種快速、經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測手段。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:70，373-375，373-374.

［2］劉娟，劉穎.丹參藥理活性成分研究進(jìn)展，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（7）:15-17.

［3］胡艷雙，侯慧先.丹參注射液穴位注射配合加味左歸飲治療黃褐斑的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，2014，21（4）:448.

［4］范歡，劉晶，張育君，等.超聲波導(dǎo)入中藥美白面膜治療炎癥后色素沉著療效觀察［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2015，24（3）:64-67.

［5］張理梅，馬玲，應(yīng)為紅，等.祛斑方對紫外線照射后色素沉著動物模型病理形態(tài)學(xué)影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（10）:3291-3294.

［6］李向軍，劉敏彥，趙興茹，等.丹參水溶性成分提取工藝研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（12）:49-50.

［7］高媛，閆艷，杜晨暉，等.丹參中總丹參酮的提取與純化［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（8）:32-34.

［8］周曉云.酶學(xué)原理與酶工程［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2005，1:57-77.

［9］HansBisswanger.PracticalEnzymology［M］.Thefirst edition，WILEY-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA，2004，1:8-15.

Study on the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid on tyrosinase and their mechanism

SONG Ji-zheng，LI Ling-jun，SUN Peng，WANG Peng
（College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Objective To study the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid，Total tanshinone on tyrosinase and their mechanism.Methods Using ultraviolet-visible spectrophotometry determines the absorbance of tyrosine enzyme catalysis to produce Dopaquinone at 490nm and calculates the Km，Vmvalues of tyrosinase through the method of Lineweaver-Burk Plot；Studying the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid，Total tanshinone on tyrosinase and their mechanism.Results Tyrosinase Km=0.2067mg·ml-1，Vm=0.0222·min-1，when the concentration of Total tanshinone reaching 2mg·ml-1，the inhibition rate was 0.00%；when the concentration of Salvia miltiorrhiza total phenolic acids reaching 10mg·ml-1；the higher Kmbecome，the lower Vmbecome.Conclusion Total tanshinone had no effects on tyrosinase，the inhibition of Salvia miltiorrhiza total phenolic acid on tyrosinase was reversible，the Inhibit type belongs to mixed type I.

Salvia miltiorrhiza；tyrosinase；total tanshinone；Salvia miltiorrhiza total phenolic；Ultravioletvisible spectrophotometry

Q591 R758.4+2

A

1008-6455（2015）22-0025-04

2015-08-10

2015-10-23

編輯/張惠娟

李凌軍，男，博士，副教授，研究方向：中藥新制劑與新技術(shù)；E-mail：lljun66@163.com