張 芳，張 鑫，楊海山，王志博，汪明香，沈國(guó)平，王 嶸，朱德銳

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

有學(xué)者認(rèn)為[1]，美白劑是通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的合成反應(yīng)鏈，減少其在皮膚內(nèi)的生成繼而達(dá)到祛斑美白效果，但美白劑對(duì)酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理及類型不明。本研究擬對(duì)四氫嘧啶(Ectoine)對(duì)酪氨酸酶的抑制作用機(jī)制及類型開展研究。

1.材料與方法

1.1 主要材料和試劑

Ectoine(純度≥95%)購(gòu)自德國(guó)Fluka Analytical公司；維生素C乙基醚(VC乙基醚)購(gòu)自山東優(yōu)索化工公司；海藻糖與熊果苷購(gòu)自河北千匯生物公司；煙酰胺購(gòu)自北京Solarbio科技公司；L-酪氨酸和酪氨酸酶(活力2.5*103U)購(gòu)自合肥博美生物科技有限公司。JB/T-5374-1991型電子天平(精確率0.1mg)購(gòu)自德國(guó)梅特勒-托利多公司；501型超級(jí)恒溫水浴箱購(gòu)自常州國(guó)華電器公司；Mili-Q Integral型純水儀購(gòu)自法國(guó)默克化工公司；754型紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海光譜儀器有限公司。

1.2 研究方案

酪氨酸酶(Tyrosinase)是體內(nèi)黑色素生物合成的關(guān)鍵靶點(diǎn)[2]。抑制劑通過(guò)抑制酪氨酸酶活力使黑色素顆粒生成減少?gòu)亩_(dá)到美白功效。據(jù)此設(shè)計(jì)研究方案如下：用分光光度法測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ectoine及與美白劑復(fù)配時(shí)對(duì)酪氨酸酶活力的抑制率；之后固定L-酪氨酸濃度，加入不同活力的酪氨酸酶，測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Ectoine對(duì)酪氨酸酶催化L-酪氨酸氧化活力的影響，判斷反應(yīng)類型；再固定酪氨酸酶活力，改變L-酪氨酸濃度，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Ectoine對(duì)酶活力的影響，以 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法判斷Ectoine的抑制類型。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

磷酸緩沖溶液(PBS緩沖液)的配置：精密稱取Na2HPO43.55 g、NaH2PO43.90 g，混合后用去離子水溶解定容至100 mL，調(diào)節(jié)pH約6.8左右。1.0 mmol/L酪氨酸溶液的配制：精密稱取L-酪氨酸0.18 g，加入5 mL鹽酸(0.1mol/L)溶解后，加約95 mL PBS緩沖液，調(diào)節(jié)pH約6.8左右，后定容至100 mL。酪氨酸酶溶液的配置：將酪氨酸酶(酶活力：2.5×103U)溶于250 mL PBS緩沖液中，制成酶活力為100 U/mL的酪氨酸酶溶液。上述配制溶液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酪氨酸酶抑制率測(cè)定

酪氨酸酶抑制率測(cè)定參照文獻(xiàn)[3]方法，反應(yīng)液組成與配比見表1。將L-酪氨酸溶液、PBS緩沖液和測(cè)試液依次加入A1、A2、A3和A4試管中，充分混勻，置37 ℃恒溫水浴箱加熱5 min。再將酪氨酸酶溶液依次加入到A1、B1試管中混勻，反應(yīng)15 min，測(cè)定各組吸光值(475 nm)并計(jì)算抑制率(I%)。I%=[1-(B1-B2)/(A1-A2)]，式中A1、A2、B1和B2為各組的吸光度值。

1.3.3 Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制率測(cè)定

配制不同濃度的Ectoine水溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，參照1.3.2方法測(cè)定酪氨酸酶抑制率。

1.3.4 Ectoine與美白劑復(fù)配時(shí)對(duì)酪氨酸酶的抑制率測(cè)定

選取0.5%熊果苷、2.0%煙酰胺和2.0%VC乙基醚[4]與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ectoine進(jìn)行復(fù)配，參照1.3.2方法測(cè)定酪氨酸酶抑制率。

1.3.5 對(duì)酪氨酸酶活性的抑制性質(zhì)分析

在同一底物酪氨酸質(zhì)量濃度下，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的Ectoine對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用。固定底物L(fēng)-酪氨酸濃度(1.0mmo/L)，改變酶含量(40、60、80和100U/mL)和Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測(cè)定吸光值A(chǔ)475。以酪氨酸酶的活性作為橫坐標(biāo)，A475作為縱坐標(biāo)，分析不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下Ectoine對(duì)酪氨酸酶活性的抑制關(guān)系。

1.3.6 對(duì)酪氨酸酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)分析

為確定Ectoine的抑制類型，對(duì)Ectoine進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖得動(dòng)力學(xué)曲線，探討抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的抑制類型[5]。固定酪氨酸酶含量(100U/mL)，改變底物L(fēng)-酪氨酸質(zhì)量濃度(0.25、0.5和0.75和1.0mmol/L)和Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測(cè)定吸光度值A(chǔ)475。以底物L(fēng)-酪氨酸濃度的倒數(shù)值為橫坐標(biāo)，以A475的倒數(shù)值為縱坐標(biāo)，確定Ectoine的抑制類型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制率

不同濃度的Ectoine(質(zhì)量分?jǐn)?shù)%，w/v)對(duì)酪氨酸酶的活性抑制率見圖1和表2。圖1和表2顯示，酪氨酸酶的活性抑制率隨Ectoine的濃度升高而抑制效果增加，當(dāng)Ectoine濃度為2.0%時(shí)，其平均抑制率為36.33%。當(dāng)Ectoine濃度大于2.0%時(shí)，抑制率升高趨勢(shì)平緩，計(jì)算可知半抑制濃度(IC50)為4.58 g/L。由此表明Ectoine能夠抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素的生物合成，具備潛在的美白效果。

表2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制率

圖1 Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制率

2.2 復(fù)配使用Ectoine與美白劑對(duì)酪氨酸酶的抑制率

不同濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Ectoine分別與3種美白劑(脫氧熊果苷、煙酰胺和VC乙基醚)進(jìn)行復(fù)配，測(cè)得的酪氨酸酶活性抑制率見表3。表3顯示，脫氧熊果苷與Ectoine復(fù)配時(shí)，7個(gè)濃度梯度間的酪氨酸酶抑制率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明Ectoine不能促進(jìn)熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。當(dāng)Ectoine與煙酰胺復(fù)配時(shí)，7個(gè)濃度梯度間的酪氨酸酶抑制率均明顯上升(P<0.01)，表明Ectoine與煙酰胺復(fù)配對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有協(xié)同促進(jìn)效果。Ectoine與VC乙基醚復(fù)配時(shí)，7個(gè)濃度梯度間的酪氨酸酶抑制率均明顯上升(P<0.01)，表明Ectoine與VC乙基醚復(fù)配時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有協(xié)同促進(jìn)效果。此外，Ectoine對(duì)煙酰胺的促進(jìn)作用總體上優(yōu)于VC乙基醚，且在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，抑制率約為66.17%，抑制效果最佳。

表3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ectoine與三種美白劑復(fù)配時(shí)對(duì)酪氨酸酶的抑制率

2.3 Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制性質(zhì)分析

由2.1結(jié)果可知，當(dāng)Ectoine濃度大于2.0%時(shí)，抑制率升高趨勢(shì)平緩，故選取2.0%(含2.0%)的4個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5%)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。固定底物L(fēng)-酪氨酸酶濃度為1.0 mmol/L，改變酶含量(40、60、80和100U/mL)和Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測(cè)定吸光值A(chǔ)475，結(jié)果見圖 5。圖 5顯示，在相同酶活力下，隨著Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，A475吸光值逐漸變小，直線的斜率下降，說(shuō)明Ectoine對(duì)酪氨酸酶的作用屬于可逆抑制。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制作用關(guān)系圖

2.4 Ectoine對(duì)酪氨酸酶的活性動(dòng)力學(xué)分析

由2.3結(jié)果可知，Ectoine對(duì)酪氨酸酶活性的抑制屬于可逆抑制。可逆抑制分為競(jìng)爭(zhēng)型、非競(jìng)爭(zhēng)型、反競(jìng)爭(zhēng)性型和線性混合型。固定底物酪氨酸酶含量(100U/mL)，改變L-酪氨酸酶濃度(0.25、0.5、0.75和1.0mmol/L)和Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)，測(cè)定吸光值A(chǔ)475，通過(guò)Lineweaver-Burk 取雙倒數(shù)圖判斷抑制類型，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、3.0%、4.0%和5.0%時(shí)的線性方程分別為y=2.827x+10.67(R2=0.989)、y=3.212x+11.79(R2=0.990)、y=3.654x+13.49(R2=0.989)、y=4.105x+15.05(R2=0.995)，其中Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖相交于橫軸的一點(diǎn)，A475吸光值隨著Ectoine的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而變小，抑制常數(shù)(Km=0.41g/L)不變，反應(yīng)速度隨Ectoine質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而減小，符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型的特征。

圖3 Ectoine抑制酪氨酸酶動(dòng)力學(xué)曲線圖

3.討論

美白劑對(duì)酪氨酸酶的抑制作用機(jī)理各有不同，嚴(yán)航等[6]發(fā)現(xiàn)薏苡仁提取液對(duì)酪氨酸酶有一定抑制作用，IC50為1.4 mg/mL，抑制類型為可逆線性混合型；孫勁毅等[7]發(fā)現(xiàn)茶皂素對(duì)酪氨酸酶有一定抑制作用，IC50為48 g/L，抑制類型為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制；劉琦等[4]發(fā)現(xiàn)熊果苷、煙酰胺以及VC乙基醚對(duì)酪氨酸酶活性均具有抑制效果，抑制類型為可逆非競(jìng)爭(zhēng)性抑制型。本研究結(jié)果顯示，Ectoine對(duì)酪氨酸酶具有一定抑制作用，IC50為4.58 g/L；Ectoine與VC乙基醚或煙酰胺復(fù)配時(shí)，酪氨酸酶的抑制效果明顯提高，尤以2.5% Ectoine最佳，抑制率分別為75.03%和66.17%；而Ectoine與脫氧熊果苷復(fù)配時(shí)對(duì)酪氨酸酶的抑制作用無(wú)明顯提高。另外，實(shí)驗(yàn)通過(guò)分別固定L-酪氨酸濃度和酶含量，測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Ectoine對(duì)酪氨酸酶抑制的影響，判斷其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用類型和作用機(jī)制，結(jié)果表明Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制類型和作用機(jī)制為可逆抑制中的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，Km為0.41 g/L。故由結(jié)果可推斷Ectoine對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是通過(guò)降低酶的活力，與酪氨酸酶分子上的獨(dú)立部位結(jié)合，而不與底物L(fēng)-酪氨酸競(jìng)爭(zhēng)活性中心。

綜上所述，Ectoine對(duì)酪氨酸酶有一定的抑制作用，與VC乙基醚、煙酰胺分別復(fù)配對(duì)酪氨酸酶的抑制作用具有協(xié)同效果，其作用機(jī)制及類型為可逆抑制中的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。