馬倩倩，張 昱，申香群，朱沁芳，杜忠蕾，Muhammad Shoaib Tahir，周義玲，袁周陽，劉 杰，汪曉洲，張 偉*

(1.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001；2.青海省高原醫(yī)學應用基礎重點實驗室，青海 西寧 810001；3.青海大學附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；4.四川大學華西醫(yī)院，四川 成都 610041)

低壓低氧對人體各系統(tǒng)有顯著的損害性影響，尤以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為重。研究表明，Claudin-5、Occludin和ZO-1是目前公認的緊密連接相關蛋白，這些蛋白的改變直接影響血腦屏障的結構和功能。Tetsuhiro等人[1]在小鼠腦創(chuàng)傷的模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織中的HIF-1α表達上調可引起AQP4的表達上調致BBB通透性的增加。本研究通過研究急性低壓低氧對大鼠腦組織的HIF-1α、AQP4和緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1的表達和形態(tài)學變化，探討急性低壓低氧對大鼠血腦屏障相關連接蛋白和通透性的影響。

1.材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡健康雄性SD大鼠48只，體重200±20 g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2018-001。動物的使用和處理經(jīng)青海大學醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。大鼠飼養(yǎng)在青海大學醫(yī)學院動物房，飼養(yǎng)環(huán)境：海拔2 260 m(574mmHg，PO2120.1mmHg)，清潔級，溫度為(20±2)℃，相對濕度為(40±5)%；晝/夜交替(12：12)；自由攝取標準維持顆粒飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)和水。適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為正常對照組和7000m低壓低氧24、48、72h組，對照組大鼠不做任何處理，其余3組大鼠放入低壓艙(模擬海拔7000m，305mmHg，PO263.7mmHg)。

1.2 實驗試劑與儀器

Evens Blue(Sigma，貨號：E2129)，甲酰胺(Sigma，貨號：V900064)，H.E.染色試劑盒(Solarbio，貨號：G1120)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，貨號：RR047A)，TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ(Takara，貨號：RR820A)，Anti-beta Actin antibody(Abcam，貨號：ab115777)，Anti-Aquaporin 4 antibody(Abcam，貨號：ab46182)，Anti-Occludin antibody(Abcam，貨號：ab167161)，ZO-1 Polyclonal Antibody(Invitrogen，貨號：61-7300)，BCA蛋白測試盒(Thermo Fisher Scientific，貨號：A53225)，12-230 kDa Wes Separation Module(PorteinSimple，貨號：SM-W004)。實驗動物低壓模擬艙(西安富康空氣凈化設備工程有限公司，型號：HCPⅢ D800)，酶聯(lián)免疫檢測儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司，型號：infinite M200 PRO)、石蠟切片機(德國萊卡儀器有限公司，型號：LEICA RM2235)、實時熒光定量PCR儀(Bio-rad，型號：CFX96)、全自動蛋白質表達定量分析系統(tǒng)(PorteinSimple，型號：WesTM)。

1.3 PCR 引物序列

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢大鼠(Rattus norvegicus)mRNA相應的基因號[AQP4(NM_001142366.2)；Claudin-5(NM_001106266.1)；Occludin(NM_031329.2)；ZO-1(NM_031701.2)；HIF-1α(NM_024359.1)；actin(NM_031144.2)]，委托TAKARA公司合成，引物序列如表 1所示。

表1 PCR 引物序列

1.4 實驗方法

1.4.1 血腦屏障通透性測定

每組取大鼠6只，在解剖前24h于腹腔注射2% EB溶液(2mL/kg體重)。24h后麻醉，迅速取出全腦用濾紙吸凈血液，然后從中間切成兩半。稱取100 mg右側半腦，加入3 mL甲酰胺，剪碎、孵育(60℃，24h)、離心取上清液。用酶標儀測定620 nm波長處已知不同濃度EB上清液的OD值，根據(jù)標準曲線計算各組大鼠腦組織中的EB含量。

1.4.2 相關基因mRNA表達量檢測

取大鼠腦組織100 mg ，按Trizol試劑說明提取組織總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。嚴格按照TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ試劑盒說明書進行逆轉錄反應，采用CFX96實時熒光定量PCR儀進行兩步法擴增。實驗所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，以管家基因actin的Ct值標準化目的基因Ct值，檢測HIF-1α、AQP4和緊密連接Claudin-5、Occludin、ZO-1 mRNA的表達量。

1.4.3 AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表達水平檢測

在冰上稱取腦組織約50 mg，加適當比例RIPA蛋白裂解液用全自動研磨儀勻漿，靜置(4℃，30min)裂解、離心(4℃，12000r/min，20min)，取上清液測定蛋白濃度。根據(jù)Wes Separation Modul說明書要求制備蛋白樣品并加樣，實驗結果以目的條帶灰度值/β-actin灰度值表示。

1.4.4 病理學觀察

每組取大鼠2只，麻醉，迅速解剖，完整取出大腦，立即用0.9%生理鹽水清洗、10%中性甲醛溶液固定，固定2天后，切取腦片做樣品，并繼續(xù)固定，用常規(guī)方法制片于光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法

2.結果

2.1 腦含水量測定結果

與對照組相比，低壓低氧72h組腦含水量增加，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各處理組間大鼠腦組織含水量無顯著性差異(P>0.05)，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 腦含水量測定結果

2.2 血腦屏障通透性測定結果

與對照組相比，低壓低氧24h組和72h組EB含量呈升高趨勢，低壓低氧48h組EB含量降低，具體數(shù)據(jù)見表3。其中，低壓低氧24h組EB含量顯著增加(P<0.05)，而低壓低氧72h組EB含量增加無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但低壓低氧48h組EB含量顯著下降(P<0.05)。

表3 血腦屏障通透性測定結果

2.3 相關基因mRNA的表達量檢測結果

大鼠腦組織相關基因mRNA表達量檢測結果如表4所示。AQP4 mRNA表達量在各組間大鼠無顯著性差異。與對照組、低壓低氧24h組、72h組相比，低壓低氧48h組Claudin-5 mRNA表達量明顯增多，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低壓低氧48h組和72h組，與對照組、低壓低氧24h組相比，Occludin mRNA和ZO-1 mRNA的表達量明顯增多(P<0.05)。與對照組、低壓低氧24h組、48h組比較，低壓低氧72h組HIF-1α mRNA的表達量明顯增多，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 相關基因mRNA的表達量檢測結果

2.4 AQP4、Occludin、ZO-1蛋白的表達水平檢測結果

與對照組相比，低壓低氧24h組和48h組AQP4蛋白表達水平無明顯差異，統(tǒng)計學無意義(P>0.05)；低壓低氧72h組大鼠腦組織AQP4蛋白表達明顯上升，差異具有顯著性(P<0.05)，具體情形見圖1。相比于對照組、低壓低氧24h組和48h組，低壓低氧72h組Occludin蛋白表達水平明顯上升，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體情形見圖2。與對照組相比，低壓低氧48h組ZO-1蛋白表達水平明顯上升，差異具有顯著性(P<0.05)，具體情形見圖3。

*：與對照組比較，P<0.05；#：與7000m24h組比較，P<0.05；$：與7000m48h組比較，P<0.05

*：與對照組比較，P<0.05；#：與7000m24h組比較，P<0.05；$：與7000m48h組比較，P<0.05

*：與對照組比較，P<0.05

2.5 大鼠腦組織病理學觀察結果

對照組大鼠腦組織結構完整，神經(jīng)元形態(tài)正常，血管外周間隙小。經(jīng)過不同缺氧條件的處理后，低壓低氧各組神經(jīng)元核深染，細胞周間隙和血管周間隙開始增大。與對照組相比，低壓低氧24h組形態(tài)變化不明顯；低壓低氧48h組偶見細胞空泡化；低壓低氧72h組大鼠腦組織細胞空泡化增多、水腫明顯，膠質細胞增生顯著，具體情形見圖4。

A：正常對照組，B：7000m24h組，C：7000m48h組，D：7000m72h組

3.討論

本研究結果顯示，急性低壓低氧可使腦組織HIF-1α表達呈時間依賴性升高，通過影響AQP4、Occludin、ZO-1蛋白表達水平，增加低壓低氧下血腦屏障的通透性。

本研究通過對西寧地區(qū)(海拔2260m)飼養(yǎng)大鼠和經(jīng)模擬低壓艙(海拔7000m)處理的大鼠進行研究，探討急性低壓低氧對大鼠血腦屏障通透性和緊密連接蛋白表達的影響。研究結果顯示，對照組大鼠較為活躍，而各低壓低氧處理組大鼠出現(xiàn)活動度降低、進食飲水偏少、背毛豎立、體重下降等現(xiàn)象，尤其以低壓低氧48h組最為嚴重，這種改變與發(fā)生高原反應人群的臨床表現(xiàn)(如情緒焦躁、厭食、運動失調)相吻合[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，低氧會引起HIF介導的多個基因的轉錄翻譯改變，引起機體能量代謝失調、體液平衡紊亂和氧化應激發(fā)生……

開展血腦屏障通透性的相關研究，可以為多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展機制和提高臨床治療效果提供理論依據(jù)[4]。濕干重法是基于完全脫水前后的腦組織重量測定的，將脫水前的重量表示為“濕重”，脫水后的重量表示為“干重”。實驗結果顯示，各組間大鼠腦含水量無顯著性差異，表明急性低壓低氧暴露未引起腦組織含水量明顯變化。由于顱腔本身容積有限且顱骨彈性很小，其顱內容積代償僅為整個顱腔容積的10%。據(jù)相關文獻報道，濕干重法是一種較為粗略的評估方式，存在一定的實驗誤差[5]。在正常生理條件下，血腦屏障(blood brain barrier，BBB)結構的完整性保證了蛋白質及其他的大分子物質不能透過BBB，當腦組織受到損傷時，由于白蛋白是血液中分子量最小的蛋白，因此可最先通過BBB，注射EB后，EB可與白蛋白結合進入腦組織，作為檢測BBB是否被破壞的示蹤劑[6]。血腦屏障通透性測定結果顯示，與對照組相比，低壓低氧24h組EB含量顯著增多，表明7000m24h組大鼠腦組織已經(jīng)受損，BBB遭到破壞，導致通透性增強，蛋白質及其他大分子物質便可通過BBB。這一實驗結果與Schoch等人的研究結果相吻合，他們發(fā)現(xiàn)低氧小鼠BBB通透性增加導致熒光素染料滲漏增多[7]。EB在腦組織中的含量增加，表明BBB細胞旁通路開放，該“裂隙”通常被緊密連接蛋白調控。

腦微血管內皮細胞之間的緊密連接是血腦屏障的結構基礎，是具有調節(jié)作用的復雜細胞系統(tǒng)。現(xiàn)有研究表明，Claudin-5、Occludin、ZO-1是目前公認的緊密連接相關蛋白，這些蛋白的改變直接影響血腦屏障的結構和功能。本實驗評估了緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、ZO-1 mRNA的表達量以及Occludin、ZO-1蛋白的表達水平。結果顯示，低壓低氧48h組Claudin-5 mRNA的表達量明顯高于對照組、低壓低氧24h組和72h組，且具有統(tǒng)計學意義。Claudin-5是血腦屏障上表達最豐富的緊密連接蛋白[8]，對小分子物質細胞旁路通透性的調節(jié)起著重要作用。研究表明[9]，缺氧預處理可在創(chuàng)傷性腦損傷早期上調Claudin-5的表達，從而增強腦血管內皮細胞緊密連接的功能，進而保護血腦屏障的完整性，減輕創(chuàng)傷性腦損傷內片后腦水腫的發(fā)生。某些藥物可增加claudin-5的表達，通過增加跨內皮阻抗(transepithelial electrical resistance，TEER)減少BBB的通透性[10]。與正常對照組和低壓低氧24h組相比，低壓低氧48h和72h組大鼠Occludin、ZO-1 mRNA的表達量明顯增多，具有統(tǒng)計學意義。Western blot結果顯示，相比于對照組、低壓低氧24h組和48h組，低壓低氧72h組大鼠腦組織Occludin的表達明顯上升。與對照組相比，低壓低氧48h組大鼠腦組織ZO-1的表達明顯上升，且差異具有顯著性。BBB的結構穩(wěn)定與緊密連接蛋白的表達、翻譯后修飾、亞細胞定位和蛋白-蛋白的交互作用有關。EK等[11]研究了新生兒缺氧缺血性腦病模型中血腦屏障和局部腦血流的變化，發(fā)現(xiàn)缺氧數(shù)小時后血腦屏障通透性增加，這種屏障的開放與緊密連接蛋白基因表達上調有關。當ATP缺乏時，緊密連接的胞質附著蛋白7H6能可逆地與緊密連接蛋白分離，而細胞間的ZO仍保持連接致細胞間通透性增高[12]。在缺氧早期，緊密連接蛋白的表達和定位均無變化，隨著缺氧時間的延長，它們才開始重新分布。Wachtel等[13]認為BBB緊密連接蛋白對缺氧有一定耐受性，缺氧僅使緊密連接“門”的功能受到影響，但是其“柵欄”功能仍可保留一段時間。

水通道蛋白是一類促進水分子和其他小分子被動轉運的跨膜蛋白。AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起主導性作用的水通道蛋白。動物學研究提示[14]，缺氧后AQP4的表達具有一定的時間依賴性。星形膠質細胞主要通過活性物的分泌、基因的轉錄和蛋白質的合成協(xié)同作用參與BBB的維持與形成。目前認為星形膠質細胞通過其足突上高表達的AQP4調控腦的水平衡[15]。本實驗結果顯示，與對照組相比，7000m72h組大鼠腦組織AQP4的表達明顯上升，且具有統(tǒng)計學意義。HIF-1α在細胞低氧應答反應中起核心作用，當組織器官出現(xiàn)缺血缺氧表現(xiàn)時，細胞內普遍出現(xiàn)HIF-1的聚集，加強糖酵解反應，為細胞提供能量，從而改善細胞的物質代謝水平，緩解高原低氧對人體的影響[16]。正常條件下，HIF-1α很少表達，但在缺氧情況下其表達明顯上調。本研究結果顯示，與對照組相比，低壓低氧組大鼠腦組織HIF-1α mRNA表達量均呈時間依賴性升高(P<0.05)。Tetsuhiro等人[1]在小鼠腦創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織中HIF-1α表達上調，進而可以使AQP4以及MMP9的表達上調而致BBB通透性增加。研究表明[17]，在低氧血癥基礎上，高碳酸血癥可以通過調控HIF-1α-AQP4-MMP9信號通路，最終增加血腦屏障的通透性。

綜上所述，急性低壓低氧狀態(tài)下，HIF-1α表達呈時間依賴性升高，通過影響AQP4、Claudin-5、Occludin和ZO-1的表達，提高血腦屏障通透性致血腦屏障破壞。