王 琦，張立雪，李淑楨，李長興，吳佩峰，代冬芳*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，甘肅 蘭州 730000)

有研究發(fā)現(xiàn)，二十五味鬼臼丸對圍絕經(jīng)期綜合征(perimenopausal syndrome，MPS)有良好的預(yù)防及治療作用[1-3]，但機制不明。本研究以MPS大鼠模型為研究對象，檢測二十五味鬼臼丸對大鼠模型血清激素的變化及子宮組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)亞型的表達(dá)的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

3月齡SD雌性大鼠48只，體質(zhì)量200～220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心所提供，動物許可證號：SCXK(陜)2017-003。

1.1.2 實驗藥物及試劑

戊酸雌二醇片(生產(chǎn)批號：201710BJ125)由拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)；二十五味鬼臼丸(國藥準(zhǔn)字Z20140539)由青海省藏醫(yī)院生產(chǎn)；大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒由江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司生產(chǎn)；TRIzol Reagent由Ambion公司提供；PCR引物由TaKaRa公司提供；RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒由天根生化科技公司提供；β-actin、大鼠ERα、ERβ多克隆抗體由Abcam公司提供；兔SP試劑盒由中杉金橋公司提供；

1.1.3 實驗儀器

離心機由Eppendorf公司提供；多功能酶標(biāo)儀由BioRad公司提供；Nanodrop(2000)由Thermo公司提供；Light Cycler96實時熒光定量PCR儀由Roche公司提供；熒光顯微鏡由Nikon公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模及給藥方法

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(OXV)、雌二醇組(OVX+E2)、二十五味鬼臼丸組(OVX+GJ)，每組12只。根據(jù)苗明三等[4]提供的方法制備MPS動物模型，Sham組切除卵巢旁等體積脂肪組織，不摘卵巢，其余各組結(jié)扎血管后完整切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后給予青霉素(20萬U/只，肌肉注射，每天1次，連續(xù)3天)。術(shù)后第5 天對動物逐只進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)5天若動物不出現(xiàn)動情期反應(yīng)則表示造模成功，OVX組有10只，OVX+E2和OVX+GJ組各有9只造模成功。術(shù)后2周開始給藥，OVX+E2組予戊酸雌二醇(0.1mg/kg，蒸餾水配成0.01mg/mL的混懸液)，OVX+GJ組予二十五味鬼臼丸(360mg/kg，蒸餾水配成0.36g/mL的混懸液)；Sham組和OVX組予等體積生理鹽水(灌胃，持續(xù)給藥12周)。給藥完成后于腹主動脈取血并分離獲得上清液，取部分子宮組織置4%多聚甲醛液固定，取部分子宮置液氮保存。

1.2.2 血清FSH、LH、E2含量檢測方法

嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定血清FSH、LH、E2含量，將酶標(biāo)儀測得的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣本濃度。

1.2.3 子宮ERα、ERβmRNA的表達(dá)檢測方法

取約100 mg子宮組織，按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用核酸分析儀檢測RNA濃度及純度后檢測吸光度。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件：42 ℃，15 min；95 ℃，3 min，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，記錄各樣本Ct值。運用2-ΔΔCt相對定量法計算目的基因相對表達(dá)差異值，每個樣本的ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，基因序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4 ERα、ERβ蛋白表達(dá)檢測方法

將5 μm子宮石蠟切片烤片(60℃，2h)，用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、PBS(pH7.4)在脫色搖床上洗滌(3次，每次5min)。以高壓行抗原修復(fù)后，滴加一抗ERα(1：200)、ERβ(1：200)孵育(4℃)過夜。次日用PBS沖洗(3次，每次3min)后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育(30min)，用PBS沖洗(3次，每次3min)。每組切片在相同視野下(×200)選取3張，用Image 6.0軟件計算陽性結(jié)果灰度平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 二十五味鬼臼丸對MPS大鼠模型血清FSH、LH、E2表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與Sham組比較，OVX組大鼠血清E2降低(P<0.05)，而LH、FSH增高(P<0.05)。與OVX組比較，OVX+E2組和OVX+GJ組血清E2增高(P<0.05)，LH、FSH降低(P<0.05)，見表2。

表2 二十五味鬼臼丸對大鼠血清E2、LH、FSH水平的影響結(jié)果

2.2 二十五味鬼臼丸對MPS大鼠模型子宮ERα、ERβmRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，OVX組ERαmRNA、ERβmRNA表達(dá)低于Shan組(P<0.05)，OVX+E2組表達(dá)高于OVX組(P<0.05)。與OVX組比較，OVX+GJ組ERαmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ERβmRNA表達(dá)升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組子宮ERα、ERβmRNA相對表達(dá)量

2.3 二十五味鬼臼丸對MPS模型大鼠子宮ERα和ERβ蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，ERα在Sham組主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，ERβ在除OVX組以外的各組大鼠子宮的腺上皮中均有表達(dá)，見圖1。與Sham組大鼠比較，OVX組ERα、ERβ的蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。給藥12周后，與OVX組比較，OVX+E2組ERα、ERβ的蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)，OVX+GJ組ERα表達(dá)未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，ERβ的蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)，見表4。

圖1 二十五味鬼臼丸對子宮組織中ERα、ERβ蛋白表達(dá)的影響圖(×200)

表4 各組子宮ERα、ERβ蛋白表達(dá)量

3.討論

ER是類固醇激素受體超家族的成員之一，能與雌激素特異性結(jié)合，其亞型有ERα和ERβ，前者主要分布在子宮、乳腺、膀胱、腦、垂體、卵巢，后者分布于心臟、骨、前列腺、唾液腺、睪丸等?！斑x擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”(selective estrogen receptor modulators，SERMs)是指對ERα或ERβ有激動作用而對另一亞型無作用的藥物，其選擇性的關(guān)鍵是SERMs與ER形成復(fù)合體與蛋白聯(lián)合調(diào)解因子相互作用，進(jìn)而影響受體配體復(fù)合物轉(zhuǎn)錄的活性[5]。SERMs的激動作用可通過轉(zhuǎn)錄激活因子1(activating transcription factor，AF-1)路徑激活基因轉(zhuǎn)錄分子機制來實現(xiàn)，SERMs拮抗雌激素作用是通過其與ER競爭性結(jié)合，阻止或抑制基因轉(zhuǎn)錄的輔調(diào)節(jié)蛋白因子與轉(zhuǎn)錄激活因子2(activating transcription factor，AF-2)表面的結(jié)合而實現(xiàn)。鬼臼與哺乳動物的類固醇激素17β-雌二醇是具有相似結(jié)構(gòu)的多羥基化合物，因此在體內(nèi)能與ER結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，鬼臼類木脂素對ERβ的親和力高于ERα，對ERα的親和力約為內(nèi)源性雌激素的4%，對ERβ的親和力約為內(nèi)源性雌激素的87%；在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，其對ERβ的轉(zhuǎn)錄激活作用較ERα強1000倍。因此，推測ERβ可能是鬼臼類木脂素發(fā)揮作用的靶點。MPS最早表現(xiàn)為卵巢功能衰退，繼而表現(xiàn)為下丘腦-垂體功能退化、激素水平改變(E2，F(xiàn)SH，LH)，使其分泌抑制垂體的因子減少，導(dǎo)致下丘腦-垂體負(fù)反饋功能障礙，繼而使下丘腦-垂體-卵巢軸失衡，影響植物神經(jīng)中樞及其支配下的各臟器功能，出現(xiàn)一系列不同程度的軀體癥狀[8-9]。

本研究中的MPS模型大鼠血清E2表達(dá)水平降低，F(xiàn)SH、LH表達(dá)水平增高；ERα、ERβmRNA及蛋白水平下降。本研究結(jié)果與Katherine等[10]的結(jié)論一致。用二十五味鬼臼丸對模型大鼠連續(xù)干預(yù)12周后，血清E2表達(dá)水平增高、FSH、LH表達(dá)水平降低，說明二十五味鬼臼丸可有效降低因卵巢切除而引起的LH、FSH增高，這對于調(diào)節(jié)絕經(jīng)后內(nèi)分泌紊亂具有重要意義；RT-PCR結(jié)果顯示，大鼠子宮組織中ERαmRNA水平的表達(dá)無明顯上調(diào)，而ERβ的表達(dá)上調(diào)；免疫組化研究表明，ERα、ERβ可定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，與模型組組比較，二十五味鬼臼組的ERβ染色強度明顯大于ERα，本研究與唐雨晴等[11]的研究結(jié)果一致，說明二十五味鬼臼丸在大鼠子宮組織中與ERβ的親和力較高，通過提高ERβ表達(dá)水平，改善MPS大鼠激素水平。

本研究結(jié)果顯示，二十五味鬼臼丸對MPS大鼠血清激素及子宮組織ERβ具有調(diào)控作用，表現(xiàn)出“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”作用，這可能是其防治絕經(jīng)后MPS的作用機制之一。