施小瓊，鄧豪華，王菲菲，陳偉

福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)系，福州 350108

熒光金納米團(tuán)簇及其在生命分析中的應(yīng)用

施小瓊，鄧豪華，王菲菲，陳偉

福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)系，福州 350108

金納米團(tuán)簇（gold nanoclusters，AuNCs），一種新型的熒光納米材料，是指在一定的分子層保護(hù)下，由幾個(gè)到幾百個(gè)金原子組成的相對穩(wěn)定的分子級聚集體。由于其直徑一般小于2 nm，接近于電子的費(fèi)米波長，產(chǎn)生了類似分子的性質(zhì)，如離散的電子態(tài)、尺寸依賴的熒光發(fā)光等。熒光金納米團(tuán)簇具有尺寸小、生物相容性好、光學(xué)穩(wěn)定性好、Stokes位移大、發(fā)射光譜可調(diào)諧以及無毒等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料、熒光蛋白、熒光量子點(diǎn)等熒光探針的一些缺點(diǎn)，近年來已經(jīng)成為國際上的研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合當(dāng)前的研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)闡述金納米團(tuán)簇的性質(zhì)、制備方法及其在生物活性小分子檢測和細(xì)胞標(biāo)記成像中的應(yīng)用。

金納米團(tuán)簇；熒光探針；納米材料；制備；生命分析

納米科技已經(jīng)成為21世紀(jì)前沿科學(xué)技術(shù)的代表領(lǐng)域之一，新納米材料的開發(fā)與應(yīng)用對社會(huì)的發(fā)展有著極為深刻的影響。世界各國，都已將發(fā)展納米科技作為國家戰(zhàn)略。近年來，金納米團(tuán)簇（gold nanoclusters，AuNCs），作為一種新型的熒光納米材料，由于其易于制備、易于修飾、穩(wěn)定性好、生物相容性好，Stokes位移大等優(yōu)點(diǎn)受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。目前，這類材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物分析與檢測、催化、能源、光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)等領(lǐng)域。

AuNCs是指在一定的分子層保護(hù)下，由幾個(gè)到幾百個(gè)金原子組成的相對穩(wěn)定的聚集體。AuNCs的直徑通常小于2 nm，介于單原子和納米粒子或者大體積的貴金屬之間，該尺度接近電子的費(fèi)米波長，此時(shí)連續(xù)的能態(tài)分裂為離散的能態(tài)，并出現(xiàn)類似分子的尺寸依賴效應(yīng)［1，2］。

迄今為止，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種不同類型的熒光納米材料，包括半導(dǎo)體量子點(diǎn)［3］、石墨烯量子點(diǎn)［4］、染料摻雜納米粒子［5］、摻雜上轉(zhuǎn)換納米粒子［6］、二氧化硅納米粒子［7］、碳納米點(diǎn)［8］等。熒光量子點(diǎn)有許多優(yōu)點(diǎn)，包括顏色與尺寸相關(guān)，穩(wěn)定性高，熒光壽命長，激發(fā)譜寬，發(fā)射譜窄，可以多組分標(biāo)記同時(shí)檢測，抗光漂白能力強(qiáng)，生物相容性好，不受生物代謝的影響，可在活細(xì)胞內(nèi)保持?jǐn)?shù)月熒光等。但同時(shí)熒光量子點(diǎn)也存在著合成條件苛刻，表面難以鈍化，粒徑較大，含有毒性元素，具有閃爍現(xiàn)象，非分子冪率熒光等問題［9］，在一定程度上限制了其應(yīng)用。傳統(tǒng)的羅丹明、熒光素、哌洛寧和菲啶類熒光染料也普遍存在細(xì)胞毒副作用、光穩(wěn)定性差、激發(fā)光譜較窄發(fā)射譜寬、易被光解和對氧敏感等問題［9］。相比于這些小分子熒光染料和量子點(diǎn)，金納米團(tuán)簇具有毒性低、表面易于修飾、熒光穩(wěn)定性強(qiáng)且可調(diào)、Stokes位移大等優(yōu)點(diǎn)。隨著對金納米簇研究的深入，必將對光電子學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、能源、環(huán)境分析、功能材料學(xué)、超分子化學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。本文就金納米團(tuán)簇材料的制備、性質(zhì)及其在生命分析中的應(yīng)用做一綜述。

1 AuNCs的制備

事實(shí)上，對于貴金屬光致發(fā)光現(xiàn)象的觀察研究可以追溯到四十幾年前，但是因?yàn)榱孔赢a(chǎn)率太低［10］，當(dāng)時(shí)并沒有引起太多人的關(guān)注。然而，近些年來，國內(nèi)外的研究者們對金納米團(tuán)簇的合成方法做出了很大的改進(jìn)，提出了多種不同的方法制備水溶性好的金納米團(tuán)簇，熒光量子產(chǎn)率相比于之前也大大提高。因此，對熒光金屬納米簇的開發(fā)應(yīng)用又重新被人們所重視。

由于金納米團(tuán)簇的各項(xiàng)性質(zhì)強(qiáng)烈依賴于其尺寸和原子個(gè)數(shù)。因此，發(fā)展簡易的尺寸和原子數(shù)可控的制備方法是進(jìn)一步研究和應(yīng)用的前提。目前AuNCs的合成方法包括：微波協(xié)助合成法、超聲合成法、種子生長法、微乳液法、光照還原合成法、動(dòng)力學(xué)控制合成法、相轉(zhuǎn)移合成法、模板輔助合成法、蝕刻法等［11-13］。金屬離子在溶液中被還原更傾向于生成較大粒徑的納米粒子而不是具有熒光的小粒徑納米簇，這是由于金屬納米簇表面積大，表面活化能高，更容易聚集。因此，在納米簇表面需要有特定基團(tuán)的保護(hù)才可以避免其在溶液中進(jìn)一步聚集成沒有熒光的納米粒子。另一方面，選擇合適的保護(hù)劑和模板能很好地控制納米簇的尺寸，并能顯著影響金納米團(tuán)簇的熒光等物理化學(xué)性質(zhì)。在一定條件下，保護(hù)劑或模板劑中含有富電子原子（N、O等）或富電子基團(tuán)（-COOH、-NH2）可以在一定程度上提高熒光強(qiáng)度。熒光AuNCs可以用小分子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)、樹狀高分子、聚合物等作為保護(hù)試劑來合成［14-27］?，F(xiàn)以不同類型的保護(hù)劑或模板對熒光金納米團(tuán)簇的合成做個(gè)簡單介紹。近年來，金屬納米團(tuán)簇配體的發(fā)展趨勢如圖1所示。

圖1 用于合成貴金屬納米團(tuán)簇的配體的發(fā)展趨勢［23］Fig. 1 Trend in the ligands used for NMQCs synthesis［23］

1.1 硫醇類化合物

硫醇類化合物作為保護(hù)劑分子用于金屬納米團(tuán)簇的合成研究大概開始于20年前。受到硫醇在金表面單層自組裝等研究的啟發(fā)，Brust 等［28］最先利用硫醇類化合物用于金納米團(tuán)簇的合成。他們利用兩相法萃取氯金酸，控制硫醇分子同氯金酸的摩爾比，直接合成單分子層保護(hù)的金納米團(tuán)簇。隨后，各種改良的Brust-Schiffrin法被不斷地用于金納米團(tuán)簇的合成。目前大多采用Bottomup法（主要是液相化學(xué)反應(yīng)一步合成）。此外，文獻(xiàn)相繼報(bào)道了各種硫醇類化合物用于金納米團(tuán)簇的合成，如2，3-二巰基琥珀酸（meso-2，3-dimercaptosuccinic acid，DMSA）［29］、谷胱甘肽（glutathione，GSH）［30］、半胱氨酸（cysteine）［31］、D-3-巰基纈氨酸（DPA）［32］、二氫硫辛酸（DHLA）［24］、3-巰基丙酸［33］和二硫蘇糖醇（DTT）［34］等。硫醇類化合物是目前最常見的一種保護(hù)劑，通過較強(qiáng)的相互作用形成穩(wěn)定的Au-S鍵結(jié)合在AuNCs的表面。研究者們通過控制不同鏈長度的烷硫醇可以制備出不同發(fā)射波長的熒光金納米簇［35］。

此外，硫醇也經(jīng)常被用作蝕刻劑，通過蝕刻大粒徑的金納米粒子（AuNPs）形成小粒徑尺寸的AuNCs。Muhammed［36］等用谷胱甘肽在不同pH條件下（pH 3 和pH 7-8）蝕刻MSA-AuNCs的方法，制備兩種不同原子數(shù)的金簇Au25和Au8。Yuan［37］等報(bào)道了一種以NaOH調(diào)解的NaBH4還原的方法制備單硫醇保護(hù)、雙硫醇保護(hù)、三硫醇保護(hù)的AuNCs。通過NaOH調(diào)控AuNCs的合成速率，降低NaBH4的還原能力提高硫醇的蝕刻能力，從而制備Au25NCs（圖2）。

圖2 NaOH調(diào)解的NaBH4還原的方法制備硫醇保護(hù)的AuNCs［37］Fig. 2 NaOH-mediated NaBH4reduction method for the synthesis of thiolated AuNCs.［37］

1.2 樹狀大分子和聚合物

樹枝狀大分子（dendrimers）是一種納米級的“容器形”分子，具有多層結(jié)構(gòu)，高度枝化，分子量和結(jié)構(gòu)可控，分子內(nèi)存在空腔、外圍大量官能團(tuán)等特點(diǎn)。樹枝狀大分子可以隔絕水溶液中的金屬離子，常被用于金簇合成的模板。Dickson等［38］利用聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（PAMAM）為模板成功合成Au8NCs，改變PAMAM/ Au的濃度和PAMAM的類型［1］可以獲得發(fā)射從紫外到近紅外不同波長的金簇，量子產(chǎn)率高達(dá)42%。雖然此法合成金簇的量子產(chǎn)率極高，但因?yàn)榇朔ê铣山鸫氐耐瑫r(shí)也伴隨著大粒徑的金納米粒子的產(chǎn)生，因此產(chǎn)率較低。

大分子高聚物通常含有豐富的羧酸，因此也被用來作合成水溶性金簇的模板。Cooper等［39］用NaBH4還原的方法合成了多齒狀突起的高分子保護(hù)的金簇。這種高聚物包含一條支鏈的水溶性甲基丙酸烯單元和末端三個(gè)疏水的未反應(yīng)的硫醇部分，通過改變合成時(shí)高聚物與氯金酸的摩爾比率，可以獲得粒徑1.1-1.7 nm的金簇。Santiago González等［18］用簡單的電化學(xué)的方法制備出了僅包含兩個(gè)或三個(gè)金原子的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）保護(hù)的金簇。特別之處是，PVP-AuNCs不僅具有穩(wěn)定的電致發(fā)光特性并且表現(xiàn)出較好的磁性（圖3）。電化學(xué)方法制備金簇的優(yōu)點(diǎn)是可以較快速的制備粒徑可控的金納米團(tuán)簇。

圖3 以PVP合成僅含兩個(gè)、三個(gè)金原子的AuNCs［18］Fig. 3 Synthesis of AuNCs containing only two and three atoms in the presence of PVP［18］

模板法合成金屬納米團(tuán)簇中，聚合物是最早被使用的一類高分子化合物，不僅能使粒徑得到很好地控制，還能防止外界物質(zhì)對金納米團(tuán)簇?zé)晒獾拟缱饔?。聚磷酸鹽（polyphosphate）首次被報(bào)道用作保護(hù)基團(tuán)以防止AgNCs聚合［40］。此后，聚苯胺（polyaniline，PANI）［41］、聚酰胺氨型樹狀大分子（polyamidoamine，PAMAM）［38］、聚乙醇胺（polyethylenimine，PEI）［17］等更多用于合成金簇的聚合物被陸續(xù)報(bào)道。然而這些聚合物模板由于存在制備方法復(fù)雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，給金屬納米團(tuán)簇的合成過程增加了難度。

1.3 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)也可以作為合成金納米團(tuán)簇的模板。蛋白質(zhì)一般含有豐富的結(jié)合位點(diǎn)，可以有效地結(jié)合并進(jìn)一步還原金屬離子。Xie等［16］提出了一種簡單、綠色的一步合成方法，以BSA同時(shí)作為穩(wěn)定劑和還原劑制備出發(fā)射強(qiáng)紅色熒光的金簇。Yu等［42］首次運(yùn)用了微波加熱的方法，僅用7 min就合成了高量子產(chǎn)率的BSA-AuNCs。Yu等［27］通過CO調(diào)控改變BSA的構(gòu)象合成了不同尺寸大小的（Au4，Au8，Au10，Au13，Au25）的AuNCs。Wen等［14］用辣根過氧化物酶（HRP）合成了同時(shí)具有金簇的熒光特性和HRP的催化活性雙重作用的HRP-AuNCs。其他蛋白質(zhì)如卵清蛋白［43］、人血清白蛋白［16］，溶菌霉素［20］，人轉(zhuǎn)鐵蛋白［21］，胰島素［22］等也被用來做金簇合成的穩(wěn)定劑。以蛋白質(zhì)為模板合成金簇是目前較為常用的金簇制備方法，其制備過程簡單，反應(yīng)條件溫和。

2 AuNCs的性質(zhì)

金納米團(tuán)簇獨(dú)特的量子尺寸效應(yīng)，導(dǎo)致了離散的電子態(tài)和類似分子的性質(zhì)，使得它明顯不同于金納米粒子（表面等離子共振現(xiàn)象）和宏觀塊體，產(chǎn)生了尺寸依賴的光致發(fā)光（PL）、電致發(fā)光（ECL）和內(nèi)在磁性、高度可極化、催化活性等性質(zhì)［11，15，44-46］。也正是因此，金納米團(tuán)簇“橋接”了單原子與納米粒子，甚至與大體積貴金屬間研究的缺失環(huán)節(jié)。金簇中最高分子占據(jù)軌道和最低分子非占據(jù)軌道間（HOMO-LUMO）的能量差異被認(rèn)為是由于團(tuán)簇中原子個(gè)數(shù)的不同造成的。因而，不同尺寸不同原子數(shù)的金納米團(tuán)簇有著不同的發(fā)射波長［1，47，48］。熒光金納米團(tuán)簇具有的尺寸小、生物相容性好、比表面積大、制備條件溫和、表面易于修飾、良好的光學(xué)穩(wěn)定性、Stokes位移大、發(fā)射光譜可調(diào)諧、較高的催化活性、無毒以及水溶性好等優(yōu)點(diǎn)，使得這類材料相比于傳統(tǒng)的有機(jī)染料、熒光蛋白和量子點(diǎn)具有更多優(yōu)勢，已經(jīng)在環(huán)境金屬離子的檢測分析、生物標(biāo)記活體成像等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

盡管前人對金簇結(jié)構(gòu)做了大量的研究工作，但在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的研究中仍然有許多未知的空白。隨著X射線晶體學(xué)、質(zhì)譜學(xué)、光學(xué)技術(shù)等研究取得的突破，對金簇原子精細(xì)結(jié)構(gòu)的深入探討使得人們進(jìn)一步理解了這類材料的諸多性質(zhì)（圖4），并且已經(jīng)達(dá)到能夠控制合成具有精確原子數(shù)的金簇［49］。已有諸多對其光、電、磁、催化等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行的理論研究與歸納［2，11，44，48］。貴金屬納米團(tuán)簇最重要的一個(gè)性質(zhì)是類似分子的光吸收和強(qiáng)熒光，這一性質(zhì)在過去的十幾年中已經(jīng)被廣泛的研究。金簇的熒光性質(zhì)強(qiáng)烈依賴于尺寸、原子個(gè)數(shù)、溶劑、保護(hù)基團(tuán)等，量子產(chǎn)率通常在10% 以下，極個(gè)別達(dá)到了70%［1］。AuNCs除了熒光特性外，還有其他特殊光學(xué)特性如紫外吸收特性和電化學(xué)發(fā)光特性。

圖4 精確原子數(shù)金簇的各項(xiàng)性質(zhì)［48］Fig. 4 properties of atomically precise gold nanoclusters［48］

通過調(diào)節(jié)粒徑的大小可以使金簇的熒光發(fā)射光譜在可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)變化［1，2］。保護(hù)基團(tuán)對AuNCs的熒光性質(zhì)具有重要作用，特定的保護(hù)基團(tuán)和合成方法可以合成出特定發(fā)射波長的AuNCs［50］（圖 5）。

圖5 幾種熒光 NMNCs 的結(jié)構(gòu)和發(fā)射波長范圍［50］Fig. 5 Structure and range of emission wavelength of some fluorescent noble-metal nanoclusters［50］

圖6 （a） ITO與AuNCs間的電子轉(zhuǎn)移 （b）AuNCs的ECL機(jī)理［45］Fig. 6 （a） electron transfer between ITO and Au NCs and （b） the ECL mechanisms of AuNCs.［45］

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）有許多優(yōu)點(diǎn)，如簡單可控，低空白，較化學(xué)發(fā)光和熒光有更高的靈敏度等［51］。金簇的ECL現(xiàn)象首次被觀察到是以陽離子三乙胺（TEA）作為共反應(yīng)劑，該體系較容易受到不同金屬離子不同程度的影響，并且有對Pb2+的檢測有潛在的應(yīng)用價(jià)值［51］。Li等［45］闡述了一種固定在ITO（銦錫氧化物，Indium Tin Oxide）電極上的水溶性，低毒性的牛血清白蛋白保護(hù)的金簇（BSA-AuNCs），產(chǎn)生ECL現(xiàn)象的機(jī)理（圖 6），基于此性質(zhì)建立了一種在陰離子共反應(yīng)劑S2O82-存在的情況下檢測多巴胺的非標(biāo)記方法。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）技術(shù)是研究生物分子相互作用的有力工具，也是納米熒光探針在應(yīng)用中新興的一種方法。有機(jī)熒光染料吸收譜窄，有機(jī)熒光探針發(fā)射譜寬且?guī)в休^長的紅端拖尾，這兩者在這個(gè)體系的應(yīng)用中都存在局限性。近來有報(bào)道半導(dǎo)體量子點(diǎn)與金納米粒子或者上轉(zhuǎn)換納米粒子等形成能量共振轉(zhuǎn)移對參與FRET過程［52-55］。最近，Long Qin［56］等設(shè)計(jì)了一種基于GSH-AuNCs和氨基修飾的AuNPs能量轉(zhuǎn)移對，這種“turn-on”型的熒光方法在近紅外區(qū)檢測谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST），檢測限達(dá)到1.5 nM（如圖 7）。

圖7 基于AuNCs和AuNPs間在紅外光區(qū)的FRET現(xiàn)象檢測GST的原理［56］Fig. 7 A novel turn-on fluorescence sensing system for the detection of GST based on the FRET between AuNCs and AuNRs in the NIR Region［56］

3 AuNCs在生命分析中的應(yīng)用

3.1 生物活性小分子檢測

3.1.1過氧化氫

Chang等［57］基于11-MUA-AuNCs的熒光猝滅作用檢測H2O2。在100 nM-10 nM范圍內(nèi)，11-MUAAuNCs的熒光猝滅程度與H2O2的加入量呈良好的線性關(guān)系，檢測限為30 nM，該檢測限與其他光學(xué)傳感器相當(dāng)。Zhang等［14］開發(fā)了一種新型熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了對H2O2的高靈敏性檢測。他們以辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）為模板原位合成了雙功能型的HRP-AuNCs，該金納米團(tuán)簇既保留了HPR的高催化活性，又具有金納米團(tuán)簇的發(fā)光性質(zhì)。H2O2能夠氧化模板HRP和AuNCs之間的Au-S產(chǎn)生二硫化物，使得AuNCs表面的保護(hù)劑（HRP）不足而導(dǎo)致熒光猝滅。該法檢測過氧化氫的檢測限為30 nM。

3.1.2葡萄糖

準(zhǔn)確檢測葡萄糖的濃度在臨床診斷和食品分析中有著極其重要的意義。腦脊液中葡萄糖濃度的高靈敏、高準(zhǔn)確監(jiān)測，對評估葡萄糖在病理生理過程中的作用十分關(guān)鍵。Qiao［43］等人設(shè)計(jì)了卵清蛋白（OVA）穩(wěn)定的金簇比率熒光探針，以茜素紅硼酸為相應(yīng)信號(hào)特異性識(shí)別葡萄糖并可猝滅567 nm處的熒光信號(hào)，保留610 nm的熒光信號(hào)，以監(jiān)測大鼠腦缺血時(shí)腦中葡萄糖濃度水平。最近，Wang等［58］利用卵清蛋白（OVA）穩(wěn)定的金簇?zé)晒饽鼙贿^氧化氫猝滅的原理設(shè)計(jì)探針檢測葡萄糖。該探針有著很好的熱穩(wěn)定性、生物相容性，高靈敏度，高選擇性，檢測限為1.0μM。Molaabasi等［59］用過氧化氫敏感的血紅素包被的金簇（Hb-AuNCs）設(shè)計(jì)熒光探針用于葡萄糖的非標(biāo)記檢測，檢測限達(dá)0.21μM。該探針有很好的水溶性、生物相容性、良好的穩(wěn)定性。

3.1.3 其他

熒光金納米團(tuán)簇也有報(bào)道應(yīng)用于膽固醇［60］、尿素［61］、氨基酸及其衍生物（如半胱氨酸［62］、谷胱甘肽［63］等）、多巴胺［64］、三磷酸腺苷［65］、維他命B12［66］、微生物［67，68］、蛋白質(zhì)［69］、克侖特羅［70］、三聚氰胺［71］、戊二醛［72］、溶菌酶、環(huán)丙沙星、槲皮素等。

3.2 細(xì)胞標(biāo)記及成像

熒光成像技術(shù)是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中一個(gè)非常重要的手段，在觀測細(xì)胞及亞細(xì)胞層面的過程和現(xiàn)象中起著關(guān)鍵作用。但是，該技術(shù)所使用的絕大部分熒光染料存在著光漂白［73］和光毒性等難以克服的缺點(diǎn)，使得長時(shí)間的活細(xì)胞觀測非常困難。由于AuNCs具有熒光染料、QDs等標(biāo)記物所不具備的優(yōu)點(diǎn)如粒徑小、無毒、生物相容性好，使其成為一種理想的熒光探針，并逐漸應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記、細(xì)胞成像、細(xì)胞分化和示蹤技術(shù)等領(lǐng)域。

由于紅光比藍(lán)光或綠光穿透組織更有效，并且能減少組織損傷，降低機(jī)體的自發(fā)熒光干擾等。因此，近紅外激發(fā)和發(fā)射熒光具有臨床應(yīng)用價(jià)值。上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNP）可以通過一個(gè)非線性光學(xué)過程將較低能量的近紅外輻射轉(zhuǎn)化為較高能量的可見光。在成像方面發(fā)展非常迅速［74］。而AuNCs 可以受到可見光的激發(fā)，發(fā)射近紅外光區(qū)熒光［75］。結(jié)合這兩種材料的優(yōu)勢設(shè)計(jì)能量轉(zhuǎn)移的熒光成像探針能很大程度地減少組織損傷。

3.2.1 體外細(xì)胞標(biāo)記成像

細(xì)胞中鐵蛋白是生命體內(nèi)的一類重要儲(chǔ)鐵機(jī)構(gòu)，分布廣泛，在哺乳動(dòng)物的肝和脾中含量最多。去鐵鐵蛋白（Apoferritin）是鐵蛋白（ferritin）不含鐵的存在形式，具有籠型結(jié)構(gòu)，是天然的鐵儲(chǔ)存蛋白。已有研究表明，很多腫瘤細(xì)胞表面可以大量表達(dá)鐵蛋白特異性受體，可以通過鐵蛋白受體-鐵蛋白的結(jié)合介導(dǎo)對鐵蛋白（及去鐵鐵蛋白）的內(nèi)吞作用。Cuiji Sun［21］等設(shè)計(jì)了一種在鐵蛋白重鏈（H鏈）的亞鐵氧化酶活性位點(diǎn)上組裝兩個(gè)金納米團(tuán)簇，不僅保留了金簇本身的熒光，而且顯示發(fā)生峰紅移，并且由于這對金納米團(tuán)簇間的耦合作用，發(fā)射光譜也可調(diào)節(jié)。由于H鏈上的亞鐵氧化酶活性中心的組氨酸殘基中的咪唑環(huán)能與Au3+發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合，因此可以利用組氨酸作為控制點(diǎn)，制備金簇。這種方法能夠用于小鼠體內(nèi)腎臟的靶向成像。此外，轉(zhuǎn)鐵蛋白也被用于合成金簇，并用于A549細(xì)胞成像和定位［76］。這種利用天然鐵蛋白作為模板合成金納米團(tuán)簇進(jìn)行器官或細(xì)胞的靶向成像，具有簡單、快捷、無毒以及良好的生物相容性，是一種體內(nèi)外細(xì)胞成像的新思路。

腫瘤細(xì)胞中的葉酸受體表達(dá)上調(diào)，基于葉酸與葉酸受體結(jié)合的特異性而設(shè)計(jì)的腫瘤細(xì)胞熒光成像的金納米簇探針多有報(bào)道。Retnakumari等［77］制備了牛血清白蛋白（BSA）包被的金納米團(tuán)簇，并通過氨基將葉酸（folic acid，F(xiàn)A）與BSA連接，特異地標(biāo)記了口腔癌細(xì)胞（oral cancer KB cells）和乳腺癌細(xì)胞（breast adenocarcinoma MCF-7）。Chen［75］等人用一種近紅外熒光染料，親水性ICG 衍生物MPA標(biāo)記葉酸修飾的金簇用于腫瘤的近紅外成像，隨后，他們又用阿霉素軛合葉酸修飾的金簇用于體內(nèi)靶向的治療。實(shí)驗(yàn)表明，這兩種材料在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上都顯示了良好的治療效果。Qiao［78］等人用生物相容性良好的N-丙烯酸（ANAS）作為“Linker”將FA 與Ova-AuNCs結(jié)合作為探針用于HeLa細(xì)胞成像，該材料的熒光發(fā)射光譜在近紅外區(qū)，有效地避免了生物體的自熒光干擾。Zhou［79］等人將葉酸共價(jià)固定于二氧化硅包被的AuNCs表面作為納米探針，用于裸鼠胃癌細(xì)胞（MGC803）的熒光成像和組織的X射線計(jì)算機(jī)斷層成像（CT）。

金納米團(tuán)簇被設(shè)計(jì)成熒光探針用于細(xì)胞成像的研究中，所用的細(xì)胞多為貼壁細(xì)胞，常見的有HeLa 、A549、HepG-2、MGC803、MCF7等等。第一例將金簇探針用于懸浮細(xì)胞的熒光成像是將多齒聚合物合成的金納米團(tuán)簇用于標(biāo)記造血細(xì)胞癌的研究［80］。

Liu等［81］用胰島素成功合成了金納米團(tuán)簇，合成后胰島素分子仍保留其生物活性。他們還發(fā)現(xiàn)通過觀察C2C12肌細(xì)胞對胰島素-金納米簇的攝取效率能夠區(qū)分分化與未分化的C2C12肌細(xì)胞。

雙量子成像能夠深入組織內(nèi)部且能減少在紅外光區(qū)的光毒性［82］。因此，在活細(xì)胞成像方面有很大的應(yīng)用前景。Chou等［83］用葡聚糖制備出了金納米團(tuán)簇并將其應(yīng)用于干細(xì)胞的雙量子成像。同樣，谷胱甘肽［84］與D-青霉胺［85］合成的金納米團(tuán)簇也被成功應(yīng)用于雙量子成像。

在病理學(xué)中，細(xì)胞核的染色和定位可以反映癌變細(xì)胞的增殖活性。Lin等在正常及癌細(xì)胞的標(biāo)記方面做了較多的研究。他們將核定位信號(hào)肽（nuclear-localization signal，SV40 NLS）修飾的疏基十一烷酸-金納米簇（NLS-MUA-AuNCs）用于HeLa細(xì)胞的染色，結(jié)果顯示NLS-MUA-AuNCs在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)均呈均勻分布，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的核標(biāo)記和細(xì)胞內(nèi)成像［86］。該小組還將鏈菌親合素（streptavidin）修飾的硫辛酸-金納米團(tuán)簇（DHLAAuNCs）成功用于人肝癌細(xì)胞（human hepatoma cells，HepG2）內(nèi)源性生物素的特異性標(biāo)記［24］。Muhammed等［87］利用谷胱甘肽作保護(hù)分子代替上述方法中的硫辛酸制備金納米團(tuán)簇，也實(shí)現(xiàn)了HepG2內(nèi)源性生物素的特異性標(biāo)記。Wang等［88］把赫塞?。╤erceptin）連接到BSA制備的金納米團(tuán)簇上，然后將其應(yīng)用于SK-BR3細(xì)胞核標(biāo)記。

3.2.2 活體成像

癌癥一直是困擾人類的一大難題，癌癥的診斷及腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記尤為重要。利用有機(jī)染料作為標(biāo)記物達(dá)到對腫瘤病灶的成像是最為傳統(tǒng)的方法。然而有機(jī)染料抗光漂白能力弱，不適于長時(shí)間分子成像［73］。此外，有機(jī)染料的細(xì)胞毒性也限制其在活體標(biāo)記中的應(yīng)用。雖然QDs抗光漂白能力強(qiáng)，并已成功實(shí)現(xiàn)了對動(dòng)物及人類腫瘤的體內(nèi)成像，然而QDs中的鎘（Cd）等重金屬的毒性也給活體應(yīng)用帶來安全隱患［89］。此外，QDs的粒徑過大，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelialsystem，RES）發(fā)現(xiàn)并吞噬，造成標(biāo)記效率大大降低［90］。金納米團(tuán)簇的出現(xiàn)使這些問題迎刃而解。它憑借粒徑小、毒性弱、光穩(wěn)定性強(qiáng)和無冪率閃爍等優(yōu)勢正發(fā)展成為腫瘤標(biāo)記診斷的主力軍。

2010年He和Wang等［91］首次將金納米團(tuán)簇注入到小鼠體內(nèi)，成功實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)的腫瘤熒光成像。該小組以BSA-AuNCs為標(biāo)記材料，通過背部皮下組織和肌肉分別注入患有腫瘤的BALB/c雌性裸鼠體內(nèi)。通過實(shí)時(shí)成像，皮下組織注射后的小鼠全身淺表脈管系統(tǒng)具有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，而通過肌肉注射后，其各臟器均能清晰可見（圖8）。該小組還探討了兩種腫瘤（MDA-MB-45和Hela）在體內(nèi)的靶向研究（圖9）。Sun等［21］將鐵蛋白制備的金納米團(tuán)簇通過側(cè)尾靜脈注射方式注入到小鼠體內(nèi)進(jìn)行活體成像。他們發(fā)現(xiàn)30分鐘后，注入金納米團(tuán)簇的小鼠的脊椎兩側(cè)出現(xiàn)一個(gè)腎形熒光區(qū)域，并可保持至少7小時(shí)可見。電感耦合等離子體質(zhì)譜測定結(jié)果表明鐵蛋白-金納米團(tuán)簇主要靶點(diǎn)為肝、腎、脾等組織。Huang等［92］發(fā)現(xiàn)2 nm的硫普羅寧保護(hù)的金納米團(tuán)簇通過單次靜脈注射后，其高度積累于腫瘤組織中。此外，硫普羅寧保護(hù)的金納米團(tuán)簇廣泛分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，而直徑為15 nm的金納米粒子則僅僅只存在于細(xì)胞質(zhì)中。Zhang等［93］以金納米團(tuán)簇作為雙模態(tài)（dual-modality）成像造影劑用于熒光和X射線雙模態(tài)成像。

圖8 分別于皮下組織（A）和肌肉（B）注射100 mL AuNCs后的體內(nèi)熒光成像（C）肌肉注射后的小鼠腹部實(shí)時(shí)成像（D）解剖后小鼠各器官的熒光成像［91］Fig. 8 In vivo fluorescence image of 100 ml AuNCs injected（A） subcutaneously and （B） intramuscularly into the mice （C） Realtime in vivo abdomen imaging of intravenously injected with 200 ml of AuNCs at different time points， post injection （D） Ex vivo optical imaging of anatomized mice with injection of 200 ml of AuNCs and some dissected organs during necropsy at 5 h pi［91］

圖9 （A）MDA-MB-45腫瘤在小鼠體內(nèi)的熒光成像 （B）腫瘤組織和周圍肌肉組織的體外熒光成像。AuNCs在腫瘤病灶（白色箭頭標(biāo)記）中表現(xiàn)了很強(qiáng)的信號(hào)（紅色圓圈標(biāo)記）［91］Fig. 9 （A） Fluorescence images of mice bearing an MDA-MB-45 tumor. Strong signal from AuNCs was observed in the tumor （marked by the red circle） The arrowheads indicated the tumor （B） Ex vivo fluorescence image of the tumor tissue and the muscle tissue around the tumor from the mice used in A［91］

4 結(jié)語與展望

（1）雖然金簇作用于生物系統(tǒng)的研究已經(jīng)展開，并有了一些初步的進(jìn)展。但隨著研究的不斷深入，更多嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)也會(huì)伴隨而來。金簇本身的構(gòu)成因素復(fù)雜（元素構(gòu)成，尺寸、晶形，形態(tài)形貌，表面電性，配基等），外界條件的影響因素如溫度、pH值、溶劑、電勢等也需加以考量，如若加上更為精細(xì)復(fù)雜的生物體系統(tǒng)作為研究對象，會(huì)使研究體系的開展平添許多困難。我們需要思考：不同條件下制備的不同種類的金簇進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)理是否一致？如果整合納米探針的優(yōu)點(diǎn)到生物體結(jié)構(gòu)中并且與生物體的親和性良好？在細(xì)胞內(nèi)的這些金屬納米團(tuán)簇分配路徑如何？怎么降解？非特異性自體干擾如何排除？納米材料在生物體內(nèi)外環(huán)境的親水性疏水性如何把控？是否會(huì)影響生物體遺傳特性？是否會(huì)影響細(xì)胞生長周期，凋亡遷移等生物過程？這些問題需要更進(jìn)一步的代謝動(dòng)力學(xué)，生物安全性，毒理學(xué)研究，遺傳學(xué)等各方面更為深入的探討。同時(shí)，還需結(jié)合各個(gè)學(xué)科的優(yōu)勢，利用好最前沿的科研成果，儀器設(shè)備，推進(jìn)金簇應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)診斷，環(huán)境分析等新方法的產(chǎn)生與發(fā)展。

（2）合成方法有待進(jìn)一步發(fā)展。現(xiàn)在報(bào)道的金納米團(tuán)簇與量子點(diǎn)和有機(jī)熒光染料相比，量子產(chǎn)率仍很低（大多低于10%）。發(fā)展尺寸、粒徑、原子數(shù)可控的金納米團(tuán)簇的制備工藝需要制定可靠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制批間的差異，建立起新的分析方法也要面臨方法學(xué)驗(yàn)證的探討。此外，金納米團(tuán)簇的表面修飾可賦予其更多的功能。建立多功能、強(qiáng)熒光性能，更綠色，穩(wěn)定，生物安全性良好的金納米團(tuán)簇合成方法，也是當(dāng)前的一個(gè)任務(wù)。

（3）金納米團(tuán)簇合成機(jī)理和光學(xué)性質(zhì)研究有待進(jìn)一步深化。先前對于金納米團(tuán)簇的合成機(jī)理的解釋很少，了解其合成機(jī)理和光學(xué)性質(zhì)有利于合成高量子產(chǎn)率的金納米團(tuán)簇。某些研究中，出現(xiàn)的化學(xué)峰位移的機(jī)理也不甚清晰，因此，深入研究金納米團(tuán)簇的合成機(jī)理、影響因素和光學(xué)性質(zhì)之間的關(guān)系也將成為未來金納米團(tuán)簇研究的重點(diǎn)。此外還需進(jìn)一步深入解析其結(jié)構(gòu)晶型、催化性能、磁性等性質(zhì)。

（4）金納米團(tuán)簇的應(yīng)用領(lǐng)域有待于進(jìn)一步拓展。作為一種熒光標(biāo)記納米材料，金納米團(tuán)簇已在生物標(biāo)記和生物成像研究中顯示出巨大的應(yīng)用前景。此外，除研究金納米團(tuán)簇與蛋白質(zhì)、核酸等的響應(yīng)外，人們還應(yīng)加強(qiáng)金納米團(tuán)簇與其他生物物質(zhì)如糖類、脂類等的作用研究。這將有利于拓展金納米團(tuán)簇在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、生物過程調(diào)控等領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，科研工作者應(yīng)該進(jìn)一步改善AuNCs的一些缺點(diǎn)，提高其在分析檢測方面的應(yīng)用及拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。

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Fluorescent gold nanoclusters and their applications in biomedical analysis

SHI Xiaoqiong， DENG Haohua， WANG Feifei， CHEN Wei
Department of Pharmaceutical Analysis， Fujian Medical University， Fuzhou 350108

Gold nanoclusters （AuNCs）， a new type of fluorescent nanomaterials， refer to the molecular species which consist of a few to a hundred atoms under the protection of the molecular layer. Their diameter are generally less than 2 nm and comparable to the Fermi wavelength of electrons， bring about molecule-like properties such as discrete electronic states and size-dependent fluorescence. Recently， AuNCs have become a hot topic owing to their perfect properties including ultrasmall size， good biocompatibility， excellent optical stability， large Stokes shift， tunable emission spectra as well as non-toxic， which make up some disadvantages of the traditional fluorescent labeling materials like organic fluorescent dyes， fluorescent protein， and quantum dots. With further research， fluorescence gold nanoclusters have shown broad application prospects in the fields of chemical analysis，biomedicine， optoelectronics. In this review， we highlight the properties， preparation of AuNCs and recent advances in fluorescene determination of biological organic molecules and cell imaging.

gold nanoclusters； fluorescence bioprobe； nanomaterials； fabrication； biomedical analysis

R493

A

10.11966/j.issn.2095-994X.2015.01.03.14

2015-07-02；

2015-08-12

國家自然科學(xué)基金（21175023）

陳偉（通信作者），教授，研究方向?yàn)榧{米生物醫(yī)藥技術(shù)，電子信箱：weichen@mail.fjmu.edu.cn

引用格式：施小瓊，鄧豪華 ，王菲菲，等.熒光金納米團(tuán)簇及其在生命分析中的應(yīng)用［J］.世界復(fù)合醫(yī)學(xué)，2015，1（3）：262-271