安志剛，陳　鑫，韓黎明，張衛(wèi)兵，師希雄，張忠明（.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生化系，甘肅定西743000；.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730000）

不同發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)凝乳酶比較研究

安志剛1，陳鑫1，韓黎明1，張衛(wèi)兵2，師希雄2，張忠明2
（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生化系，甘肅定西743000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730000）

為進(jìn)一步研究解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）D4在不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長特性，該試驗(yàn)選用3種培養(yǎng)基進(jìn)行比較。菌株D4在不同培養(yǎng)基中利用營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的能力不同，這種差異體現(xiàn)在培養(yǎng)基的酶活力、pH值、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、菌體生物量的不同變化。3種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基Ⅱ產(chǎn)凝乳酶活力最高，在72 h達(dá)到最大值4 533.33 SU/mL，并且各種指標(biāo)變化平穩(wěn)，是實(shí)驗(yàn)室研究搖瓶發(fā)酵特性的首選培養(yǎng)基。

凝乳酶；解淀粉芽孢桿菌；培養(yǎng)基；發(fā)酵

凝乳酶是干酪生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵性酶，又稱天冬氨酸蛋白酶［1］。目前，干酪生產(chǎn)中應(yīng)用的凝乳酶主要有3個(gè)來源：動(dòng)物性凝乳酶、植物性凝乳酶和微生物凝乳酶，其中動(dòng)物性凝乳酶在干酪的生產(chǎn)過程中應(yīng)用最早。動(dòng)物性凝乳酶主要是小牛凝乳酶，即從小牛皺胃中提取出來，小牛凝乳酶生產(chǎn)的干酪品質(zhì)好，但是其供應(yīng)受到限制［2］。植物性凝乳酶雖然來源廣泛，但因其在干酪生產(chǎn)過程中的蛋白水解能力強(qiáng)，易使干酪產(chǎn)生苦味［3］，并且植物的生長受時(shí)間、地域、生長周期長等條件限制，難以廣泛地發(fā)展［4］。微生物凝乳酶應(yīng)用研究最晚，并且主要來源于真菌，而微生物的生長特點(diǎn)使得研究微生物凝乳酶成為熱點(diǎn)［5-6］。微生物凝乳酶中有關(guān)細(xì)菌凝乳酶的研究較少，細(xì)菌相比真菌，分裂快，代時(shí)短，發(fā)酵基質(zhì)易于處理，利用大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵，便于控制管理［7］。

國外對(duì)微生物凝乳酶的研究較早，凝乳酶的分離純化技術(shù)已很成熟，對(duì)基因工程凝乳酶和蛋白質(zhì)工程凝乳酶也已進(jìn)行了探索［8］。研究人員利用根霉、米黑毛霉、米根霉、地衣芽孢桿菌等發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶，并應(yīng)用于干酪的生產(chǎn)［9］。20世紀(jì)80年代，我國也開始研究微生物凝乳酶，產(chǎn)凝乳酶微生物主要有微小毛霉、黑曲霉、枯草芽孢桿菌等，并研究了產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性，通過研究認(rèn)為多種微生物凝乳酶可以替代小牛皺胃酶［10-13］。

本試驗(yàn)以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）D4為出發(fā)菌株，研究比較3種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株的生長及產(chǎn)酶情況，為選擇一種適合搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

脫脂奶粉、麩皮：市售；馬鈴薯廢水：馬鈴薯打漿后，用4層紗布過濾，濾液即為馬鈴薯廢水。

1.1.2菌株

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）D4為實(shí)驗(yàn)室分離獲得，保藏于中科院微生物所菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC 3290，GenBank菌株登記號(hào)為GQ918136。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ：麩皮汁18 g/100 mL（18 g麩皮在100 mL自來水中煮沸10 min，4層紗布過濾后用自來水補(bǔ)足至100 mL，pH自然），蔗糖40g/L，Na2HPO42 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ：麩皮汁18 g/100 mL，蔗糖40 g/L，Na2HPO42g/L，脫脂奶粉20g/L，pH自然，121℃，滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅲ：麩皮汁18 g/100 mL，蔗糖40 g/L，Na2HPO42 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.1.4化學(xué)試劑

牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、蔗糖、3，5-二硝基水楊酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉均為分析純：天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

GXP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱：金壇市醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；STARTER-300 pH計(jì)：奧豪斯儀器上海有限公司；HH-6數(shù)字恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；GL-12B高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；T6S紫外可見分光光度計(jì)：普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1發(fā)酵試驗(yàn)

將斜面菌種活化24h后接種于裝液量為100mL/250 mL種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h即為種子。以4%接種量將種子分別接種于裝液量為50 mL/250 mL 3種發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、170 r/min條件下發(fā)酵，每隔12 h采樣，8 000×g離心15 min，取上清液測定指標(biāo)。

1.3.2分析檢測

pH值的測定采用直接測定法；蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法［14］，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.180X+0.136，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999。還原糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法［15］，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.211X+0.001，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999。菌體生物量的測定采用分光光度法［16］。

凝乳酶活力的測定采用Arima法［17］：取5 mL 100 g/L的脫脂乳（用0.01 mol/L的CaCl2溶液溶解脫脂乳），在35℃下保溫5 min，加入0.5 mL粗酶液，迅速混合均勻，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時(shí)間（s）。凝乳酶活力的定義：把40 min凝固1 mL 100 g/L脫脂乳的酶量定義為一個(gè)索氏單位（Soxhlet unit，SU）。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：t為凝乳時(shí)間，s；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（xˉ±s）表示，多重比較采用最小顯著差別（least significant difference，LSD）方法分析，圖中不同小寫字母（a、b、c……）之間表示差異性顯著（P＜0.05），小寫字母相同表示差異性不顯著，3種培養(yǎng)基之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

菌種對(duì)不同發(fā)酵培養(yǎng)基的分解利用程度不同，在生長過程中由于底物的消耗和代謝物的產(chǎn)生，導(dǎo)致培養(yǎng)基的酶活力、pH值、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量和菌體生物量隨發(fā)酵時(shí)間變化而改變，通過比較3種培養(yǎng)基發(fā)酵過程中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，探索3種發(fā)酵培養(yǎng)基各指標(biāo)變化的差異性。

2.1發(fā)酵過程中凝乳酶活力變化

表1　不同培養(yǎng)基發(fā)酵過程中酶活力的變化Table 1 Change of the enzyme activities in different media during fermentation

從表1中看出，隨著發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)基Ⅰ的酶活在156 h達(dá)到最大值3 285.71 SU/mL，酶活整體呈現(xiàn)S型變化，不同采樣點(diǎn)酶活波動(dòng)較小，酶活穩(wěn)定性好；培養(yǎng)基Ⅱ的酶活在72 h達(dá)到最大值4 533.33 SU/mL，并且持續(xù)到84 h，整體呈現(xiàn)拋物線型變化，84 h后不同采樣點(diǎn)酶活變化較小，酶活穩(wěn)定性好，這正好應(yīng)證了前人研究結(jié)果，72 h有最大酶活［18］；培養(yǎng)基Ⅲ的酶活隨著發(fā)酵進(jìn)行，在120 h達(dá)到最大值3 619.05 SU/mL，整體呈現(xiàn)S型變化趨勢，并且不同采樣點(diǎn)酶活波動(dòng)較大，穩(wěn)定性差。3種培養(yǎng)基在整個(gè)發(fā)酵過程中，酶活力有不同程度的變化，培養(yǎng)基Ⅱ的酶活力整體明顯高于培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ，并且產(chǎn)酶穩(wěn)定性好。通過t檢驗(yàn)，培養(yǎng)基Ⅱ與培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ的酶活力變化差異顯著（P＜0.05），而培養(yǎng)基Ⅰ與培養(yǎng)基Ⅲ的差異不顯著（P＞0.05）。

2.2發(fā)酵過程中pH值變化

表2　不同培養(yǎng)基發(fā)酵過程中pH值的變化Table 2 Change of pH in different medium during fermentation

從表2中看出，隨著發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)基Ⅰ的pH值從最初接種之后的6.77下降到5.36，整體呈現(xiàn)下降趨勢，但是從整個(gè)過程來看，pH值波動(dòng)明顯，15個(gè)采樣點(diǎn)相互之間差異性顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)基Ⅱ的pH值由發(fā)酵最初的6.63下降到5.30，整體呈現(xiàn)下降趨勢，在發(fā)酵過程中pH值波動(dòng)，在60h之前波動(dòng)較大，60 h之后在5.20至5.30之間波動(dòng)，變化趨于穩(wěn)定；培養(yǎng)基Ⅲ的pH值隨著發(fā)酵進(jìn)行，由最初的6.69下降到5.84，整體呈現(xiàn)下降趨勢，整個(gè)發(fā)酵過程pH值波動(dòng)，60 h之前波動(dòng)較大，60 h之后波動(dòng)較小。3種培養(yǎng)基在整個(gè)發(fā)酵過程中，pH值在5.00～7.00，但是在發(fā)酵過程中pH值都有不同程度的波動(dòng)，3種培養(yǎng)基之間進(jìn)行t檢驗(yàn)，差異不顯著（P＞0.05），說明在3種培養(yǎng)基的整個(gè)發(fā)酵過程中，pH值變化范圍小，且穩(wěn)定。

2.3發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量變化

從表3中看出，隨著發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)基Ⅰ的蛋白質(zhì)含量在不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著（P＜0.05），變化幅度小，在156 h蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值；培養(yǎng)基Ⅱ由于添加了脫脂奶粉，其蛋白質(zhì)含量最大值在發(fā)酵最初，隨著發(fā)酵的進(jìn)行蛋白質(zhì)含量下降，在24 h之后變化幅度小，但是不同采樣點(diǎn)之間差異顯著（P＜0.05）。在84 h的酶活力最大，此時(shí)的蛋白質(zhì)含量高于培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ；培養(yǎng)基Ⅲ的蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵最初最大，整個(gè)發(fā)酵過程中變化起伏較大，在120 h蛋白質(zhì)含量明顯增加，而此時(shí)酶活力也達(dá)到最大值。3種培養(yǎng)基在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基Ⅱ的蛋白質(zhì)含量整體上高于培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ。培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ蛋白質(zhì)變化平穩(wěn)，而培養(yǎng)基Ⅲ變化幅度大。通過t檢驗(yàn)，培養(yǎng)基Ⅱ與培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ的蛋白質(zhì)含量變化差異顯著（P＜0.05），而培養(yǎng)基Ⅰ與培養(yǎng)基Ⅲ的差異不顯著（P＞0.05）。從表1和表3看出，蛋白質(zhì)含量高峰值出現(xiàn)時(shí)間與酶活力最大值出現(xiàn)時(shí)間保持一致。

2.4發(fā)酵過程中還原糖含量變化

表4　不同培養(yǎng)基發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Table 4 Change of the reducing sugar content in different medium during fermentation

從表4中看出，隨著發(fā)酵進(jìn)行，培養(yǎng)基Ⅰ的還原糖含量在不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著（P＜0.05），在12 h還原糖含量達(dá)到最大值，隨后逐漸下降并趨于規(guī)律變化；培養(yǎng)基Ⅱ由于加入脫脂奶粉，其還原糖含量整體偏高，在12 h含量達(dá)到最大，隨后下降并變化，而且不同采樣點(diǎn)之間差異顯著（P＜0.05）；培養(yǎng)基Ⅲ的還原糖含量在24 h最大，隨后下降并變化，整個(gè)發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)之間差異顯著（P＜0.05）。3種培養(yǎng)基在整個(gè)發(fā)酵過程中，還原糖含量都是先增長后下降，并且呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，整體上看，培養(yǎng)基Ⅱ的還原糖含量高于培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ。通過t檢驗(yàn)，培養(yǎng)基Ⅱ與培養(yǎng)基Ⅲ的還原糖含量變化差異顯著（P＜0.05），而培養(yǎng)基Ⅰ與培養(yǎng)基Ⅱ、Ⅲ的差異不顯著（P＞0.05）。在3種培養(yǎng)基中，酶活力最大值的出現(xiàn)明顯滯后于還原糖含量最大值的出現(xiàn)。2.5發(fā)酵過程中菌體生物量變化

表5　不同培養(yǎng)基發(fā)酵過程中菌體生物量的變化Table 5 Change of the biomass in different medium during fermentation

從表5中看出，隨著發(fā)酵進(jìn)行培養(yǎng)基Ⅰ的生物量開始增加，在24～36 h出現(xiàn)第一個(gè)高峰，隨后逐漸下降到最低值，隨后又開始增加直到最大值；培養(yǎng)基Ⅱ的生物量隨發(fā)酵增加，在24 h達(dá)到最大值，隨后下降后在60 h又出現(xiàn)一次峰值，逐步下降至發(fā)酵結(jié)束；培養(yǎng)基Ⅲ的生物量首先下降后再增加，在24 h達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)不同程度的升降變化。3種培養(yǎng)基在整個(gè)發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ的生物量都是先增長后下降，而培養(yǎng)基Ⅲ相反，呈現(xiàn)出先下降后增長，分析原因可能是加入的馬鈴薯廢水中某些物質(zhì)干擾了菌體吸光度值。整體上看，3種培養(yǎng)基在24 h都出現(xiàn)了第一次峰值，隨后變化各異。通過t檢驗(yàn)，3種培養(yǎng)基之間的菌體生物量變化差異不顯著（P＞0.05）。在3種培養(yǎng)基中，菌體生物量最大值的出現(xiàn)明顯早于酶活力最大值的出現(xiàn)。

3　討論

在整個(gè)發(fā)酵過程中，不同培養(yǎng)基的pH值都有不同程度的變化，但是變化范圍都在5.00～7.00，而且培養(yǎng)基之間的pH值變化范圍小，且穩(wěn)定。因此，菌株D4在3種培養(yǎng)基中能夠正常生長代謝。酶活力最大值應(yīng)該與蛋白質(zhì)含量高峰值相對(duì)應(yīng)，上述3種培養(yǎng)基的酶活力與蛋白質(zhì)含量變化分析也驗(yàn)證了此觀點(diǎn)。培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ的菌體生物量在24 h都出現(xiàn)了第一次峰值，而相對(duì)應(yīng)的還原糖含量在12 h出現(xiàn)峰值，在24 h時(shí)處于下降趨勢，因此表現(xiàn)出菌體生物量高峰值的出現(xiàn)滯后于還原糖含量高峰值的出現(xiàn)。由于培養(yǎng)基Ⅲ加入馬鈴薯廢水，某些物質(zhì)可能影響到吸光度值，菌體生物量在發(fā)酵起始階段表現(xiàn)出先下降后增長的異?，F(xiàn)象。從整體看，培養(yǎng)基Ⅱ的產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，而且酶活力高，在72 h達(dá)到最大值4 533.33 SU/mL，與培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅲ的酶活力變化比較，差異顯著（P＜0.05）。因此，培養(yǎng)基Ⅱ可以作為搖瓶產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基。

4　結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）D4在不同培養(yǎng)基中利用營養(yǎng)成分和代謝不同產(chǎn)物的能力不同，這種差異宏觀上體現(xiàn)在培養(yǎng)基的pH值、酶活力、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、菌體生物量等的不同變化。3種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基Ⅱ產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，產(chǎn)酶活力高，在72 h達(dá)到最大值4 533.33 SU/mL，并且各種分析指標(biāo)變化平穩(wěn)，是實(shí)驗(yàn)室研究搖瓶發(fā)酵特性的首選培養(yǎng)基。

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Comparative studies on chymosin produced by different media

AN Zhigang1，CHEN Xin1，HAN Liming1，ZHANG Weibing2，SHI Xixiong2，ZHANG Zhongming2
（1.Department of Biochemistry，Gansu University of Chinese Medicine，Dingxi 743000，China；2.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

In order to further research the growth characteristics ofBacillus amyloliquefaciensD4 in different fermentation media，three kinds of culture medium were compared in the study.The strain D4 had different abilities to use the nutrients and produced different metabolite in different culture mediums.These differences were reflected in enzyme activity，pH，protein content，reducing sugar content and biomass.The chymosin activity of medium II was the highest in the three kinds of culture medium，and could reach to the maximum 4 533.33 SU/ml at 72 h，and changes of all indicators was steady.Medium II was the preferred medium to investigate the shake flask fermentation peculiarity.

chymosin；Bacillus amyloliquefaciens；medium；fermentation

Q814.4

A

0254-5071（2015）11-0047-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.011

2015-09-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560442）；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（GNCX-2014-31）

安志剛（1984-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。