謝麗華，高 虹，陳明麗，馮 濤

(黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江哈爾濱150038)

枯草芽孢桿菌SB
--24對尖孢鐮刀菌拮抗機(jī)理

謝麗華，高 虹，陳明麗，馮 濤

(黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，黑龍江哈爾濱150038)

通過SB-24菌株對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制、菌絲形態(tài)的影響及對孢子萌發(fā)的抑制，SB-24分泌水解酶能力的研究，探索SB-24對尖孢鐮刀菌的抑制機(jī)理。結(jié)果表明:SB-24對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制作用是通過菌體及其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)，分泌水解酶 (蛋白酶和纖維素酶)共同作用的結(jié)果;SB-24對尖孢鐮刀菌孢子的抑制作用主要是其產(chǎn)生拮抗物質(zhì)作用的結(jié)果。圖4，表2，參6。

枯草芽孢桿菌;尖孢鐮刀菌;拮抗機(jī)理

0 引 言

大豆根腐病是一種分布廣、危害重［1］、病原菌種類繁多［1-5］和防治困難的世界性病害，僅黑龍江墾區(qū)的發(fā)病率即達(dá)75%～90%，常年減產(chǎn)10%～30%，重病地可減產(chǎn)60%，甚至絕收［6］，目前生產(chǎn)上主要采用35%多克福種衣劑防治，種子包衣雖然在大豆根腐病的防治中起到重要作用，但是它不僅抑制大豆結(jié)瘤、氮的固定和破壞微生物環(huán)境，而且近年來東北地區(qū)早春多低溫高濕，種衣劑藥害發(fā)生普遍，影響幼苗生長。隨著生活水平提高，環(huán)保意識增強(qiáng)，利用有益微生物拮抗病原菌進(jìn)行生物防治逐漸得到了重視。

SB-24菌株從加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)產(chǎn)食品部，加?xùn)|禾谷類和油料作物研究中心引進(jìn)，屬廣譜抗性生防菌株，經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心鑒定確定其為枯草芽孢菌。探索SB-24對尖孢鐮刀菌拮抗機(jī)理，為提高生防菌劑的穩(wěn)定性提供基礎(chǔ)性研究資料。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SB-24由加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)產(chǎn)食品部，加?xùn)|禾谷類和油料作物研究中心引進(jìn);大豆根腐病病原菌尖孢鐮刀(Fusarium oxysporum)由八一農(nóng)墾大學(xué)提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g，酵母提取物5g，氯化鈉10 g，瓊脂粉17 g，蒸餾水1 000 ml。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，蒸餾水1 000 ml。

羧甲基纖維素培養(yǎng)基(CMC):CMC-Na 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2SO40.5 g，K2HPO40.25 g，瓊脂粉17 g，蒸餾水1 000 ml。

酪素培養(yǎng)基:牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，酪素1 g，瓊脂粉17 g，pH 7.6～8，蒸餾水1 000 ml。

1.3 粗提物、無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌的抑制作用及對菌絲形態(tài)的影響研究

1.3.1 拮抗菌粗提物、無細(xì)胞濾液的制備。將SB-24菌株接種于100mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)(32℃，150 r·min-1)48 h進(jìn)行發(fā)酵，4℃離心發(fā)酵液 (8 000 r·min-1，10 min)獲得粗提物，粗提物經(jīng)微孔濾膜 (0.22μm，Φ25 mm)過濾除菌后獲得無細(xì)胞濾液用于抑菌活性測定。

1.3.2 粗提物、無細(xì)胞濾液對尖孢鐮刀菌的抑制作用。把SB-24菌株的粗提物、無細(xì)胞濾液分別按0.2∶100、0.5∶100、1∶100的比例加到約45℃的PDA培養(yǎng)基中，輕搖混勻，倒平板，待冷凝后接種尖孢鐮刀菌菌餅 (Φ6 mm)，28℃下倒置培養(yǎng)3 d～5 d。每皿重復(fù)3次，取平均值。以空白PDA平板上生長的病菌作為空白對照。

1.3.3 粗提物、無細(xì)胞濾液對禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響。挑取1.3.2處理菌落邊緣菌絲鏡檢，觀察拮抗細(xì)菌對菌絲生長的影響，以PDA培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的菌絲為對照。

1.4 粗提物、無細(xì)胞濾液對抱子萌發(fā)及其形態(tài)的影響研究

尖孢鐮刀菌孢子的制備。用100 ml無菌水沖下預(yù)先在麥粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的病原菌孢子，用4層無菌的紗布過濾，在離心機(jī)上離心5 min(1 000 r·min-1)，去除上清液，加入無菌水進(jìn)行2次離心，用無菌水重懸浮，稀釋10-1，在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，然后與等量0.5%葡萄糖溶液混合，制成孢子懸浮液，孢子數(shù)2×105～2.2×105。

孢子萌發(fā)試驗(yàn)。取無菌凹玻片，加入20 ul孢子懸浮液，然后分別加入0.2∶100、0.5∶100、1∶100的SB-24粗提物、無細(xì)胞濾液，上加無菌蓋玻片封口，將凹玻片放于經(jīng)滅菌的、含濕濾紙的培養(yǎng)皿中25℃下保濕培養(yǎng)24h，記錄孢子萌發(fā)數(shù)量。以無菌水做對照。每處理4次重復(fù)。

孢子萌發(fā)率%=孢子萌發(fā)數(shù)/總孢子數(shù)*100

孢子萌發(fā)抑制率%=(對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對照萌發(fā)率*100

1.5 SB-24產(chǎn)纖維素酶、產(chǎn)蛋白酶能力檢測

SB-24產(chǎn)纖維素酶能力測定。將活化的SB-24點(diǎn)接在CMC培養(yǎng)基上，每皿點(diǎn)接3點(diǎn)。30℃培養(yǎng)2 d，將1 mg·ml-1的剛果紅溶液5 ml滴入培養(yǎng)基上，15 min后倒去溶液，加入1 mol·L-1的NaCl溶液5 m l，15 min后倒去，觀察菌落周圍培養(yǎng)基的變化情況。

SB-24產(chǎn)蛋白酶能力測定。將活化的SB-24點(diǎn)接在酪蛋白培養(yǎng)基上，每皿點(diǎn)接3個點(diǎn)。30℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落周圍培養(yǎng)基變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌的抑制效果

SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖孢鐮刀菌均有抑制作用，抑制率達(dá)74.3%～80.4%，見表1，圖1。1%、0.5%的濃度對尖孢鐮刀菌的抑制好于0.2%的濃度;同等濃度下粗提物的作用強(qiáng)于 (除SB-24 1%)無細(xì)胞物，差異不顯著，說明SB-24對尖孢鐮刀菌的抑制作用是菌體及其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

表1 SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌的抑制效果Tab.1 The inhibition effect of crude substance and no cell filtrate of SB-24 against the growth of Fusarium oxysporum

圖1 SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of crude substance and no cell filtrate of SB-24 against the growth of Fusarium oxysporum

2.2 SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌菌絲形態(tài)影響

SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖孢鐮刀菌菌絲具有明顯的致畸作用，見圖2。正常菌絲邊緣細(xì)、直、分叉稀少、菌絲光滑，而有拮抗菌SB-24存在時菌絲嚴(yán)重交聯(lián)，節(jié)間變短、扭曲，分叉增多，形成樹狀集結(jié)，顏色加深。

2.3 SB-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌抱子萌發(fā)的影響

SB-24對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，1%SB-24無細(xì)胞物對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)抑制率最高，為73.4%，見表2。總體來說，無細(xì)胞物對孢子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于粗提物，說明主要是拮抗菌的代謝物抑制病原菌孢子萌發(fā)。

2.4 SB-24產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶能力測定

SB-24在羧甲基纖維素培養(yǎng)基上生長2天后，用剛果紅染色后，菌落周圍出現(xiàn)淺紅色水解圈，菌株在生長代謝過程中可以產(chǎn)生纖維素酶，分解培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素鈉，見圖3。

SB-24在酪蛋白培養(yǎng)基上生長2天后，菌落周圍出現(xiàn)透明水解圈，表明在生長代謝過程中產(chǎn)生蛋白酶，分解了培養(yǎng)基中的酪蛋白，見圖4。

圖2 B-24粗提物，無細(xì)胞濾液對尖抱鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響 (×10)Fig.2 The effect of crude substance and no cell filtrate of SB-24 on Fusarium oxysporum mycelium form

表2 SB-24對尖抱鐮刀菌抱子萌發(fā)的抑制作用Tab.2 The inhibition effect of SB-24 against the spore germination of Fusarium oxysporum

圖3 纖維素培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.3 Colonymorphology of SB-24 on cellulose decomposingmicroorganismsmedium

圖4 酪蛋白培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.4 Colonymorphology of SB-24 on casaminomedium

3 結(jié) 論

SB-24對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制作用是菌體及其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)共同作用的結(jié)果，對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制率達(dá)70%以上，菌絲明顯畸形，嚴(yán)重交聯(lián)，節(jié)間變短、扭曲，分叉增多，形成樹狀集結(jié)，顏色加深。SB-24可以分泌水解酶 (蛋白酶和纖維素酶)，對尖孢鐮刀菌細(xì)胞壁有一定的分解作用。

SB-24抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)主要是其拮抗菌的代謝物起作用，1%無細(xì)胞物對孢子萌發(fā)抑制作用強(qiáng)，萌發(fā)抑制率達(dá)73.4%。

［1］ 馬匯泉，辛惠普.大豆根腐病病原菌種類鑒定及其生物學(xué)研究 ［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，1988(2):115-121.

［2］ 高同春，周書其，王振榮，等.大豆根腐病病原物的分離、鑒定及致病性測定 ［J］.安微農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992，20(1):79-81.

［3］ 馬桂珍，暴增海，楊文蘭.冀東地區(qū)大豆根腐病病原菌的鑒定 ［J］.河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院，1994，8(4):70-72.

［4］ 李寶英，馬淑梅.大豆根腐病病原菌種類及抗原篩選 ［J］.植物保護(hù)學(xué)報，2000，27(1):91-92.

［5］ 韓慶新，辛惠普.大豆根腐病主要病原菌對大豆幼苗致病性的初步研究 ［J］.大豆科學(xué)，1990，9(2):157-162.

［6］ 張玉華.黑龍江省大豆根腐病的危害與防治 ［J］.大豆通報，1996(1):29.

Antagonistic M echanism of Bacillus subtilis Strain SB-24 on Fusarium oxysporum

XIE Li-hua，GAO Hong，CHEN Ming-li，F(xiàn)ENG Tao
(Institute of Plant Protection，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China)

In this study，the inhibition of strain SB-24 on the growth of Fusarium oxysporum mycelium and spore，mycelium form of Fusarium oxysporum and its capability of secreting hydrolytic enzymes were examined.The results showed that strain SB-24 inhibited the growth of Fusarium oxysporum mycelium，which wasmostly due to the integration of production of antibioticmaterial and hydrolytic enzymes including proteineous enzyme and cellulase.Antagonistic effectof strain SB-24 on Fusarium oxysporum spores is in nature the production of antibiotic material.

Bacillus subtilis;Fusarium oxysporum;antagonistic mechanism

10.11689/j.issn.2095-2961.2015.02.007

2095-2961(2015)02-0091-05

S476+.19

A

2015-01-16;

2015-04-15.

黑龍江省科技廳對外科技合作資助項(xiàng)目 (WB10B103).

謝麗華 (1980-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樯锓乐?

高虹 (1964-)，女，黑龍江哈爾濱人，學(xué)士，研究員，研究方向?yàn)樯锓乐?