王　婧，王曉丹，3，羅曉葉，邱樹毅，肖　蓓，張小龍，胡鵬剛*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

醬香大曲中高產(chǎn)蛋白酶功能細(xì)菌的篩選及鑒定

王婧1，2，王曉丹1，2，3，羅曉葉1，2，邱樹毅1，2，肖蓓1，2，張小龍1，3，胡鵬剛1，2*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

通過對醬香型大曲中的細(xì)菌進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，獲得一株高產(chǎn)蛋白酶的菌株FBKL1.0199，然后采用菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)方法，鑒定其為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。實(shí)驗(yàn)條件下該菌株所產(chǎn)中性蛋白酶高達(dá)3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力達(dá)139.27 U/g，為提高醬香型白酒品質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。

醬香大曲；高產(chǎn)蛋白酶；發(fā)酵工藝；地衣芽胞桿菌

醬香型白酒具有獨(dú)特的生產(chǎn)工藝，綜合概括其特點(diǎn)為“四高三長，一大一多”，其中高溫制曲就是“四高”之一，高溫醬香型大曲是醬香的原動力及來源。醬香型大曲的制曲溫度高達(dá)65℃，在高溫低濕的環(huán)境下，形成了特殊的微生物體系，這些微生物的代謝產(chǎn)物對醬香型白酒的風(fēng)格具有重要貢獻(xiàn)［1-2］。

醬香型大曲的制曲過程中，在其特定的工藝條件下，微生物通過自身的生長代謝可產(chǎn)生豐富的酶系，其中就包含了對白酒生產(chǎn)至關(guān)重要的蛋白酶和淀粉酶，蛋白酶可將原料中的粗蛋白降解成各種氨基酸，使得大曲中富含的氨基酸種類和數(shù)量增多。同時(shí)，淀粉酶將原料中的淀粉降解成糖，氨基酸和糖在其特殊的環(huán)境中發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成具有醬香風(fēng)味的物質(zhì)。其次，氨基酸加熱分解時(shí)也會產(chǎn)生醬香味物質(zhì)［3］。大曲不僅為釀造提供了糖化發(fā)酵劑，還為發(fā)酵提供了前體物質(zhì)［4］。

蛋白酶在白酒的釀造過程中，可以有溶解發(fā)酵原料的顆粒、促進(jìn)微生物繁殖以及分解蛋白質(zhì)生成香味物質(zhì)、降解酵母菌體蛋白等多種功能，高活力的蛋白酶可以提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量［5］。本研究從醬香大曲中通過模擬醬香大曲發(fā)酵工藝，采用福林酚法測蛋白酶活力，分離篩選出高產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌，有助于醬香大曲中高產(chǎn)蛋白酶微生物的研究，對生產(chǎn)出優(yōu)良的醬香大曲具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬香大曲：貴州珍酒釀酒有限公司提供；酪氨酸：上海長江生物制藥廠；干酪素、無水碳酸鈉、磷酸二氫鉀：天津市海光化學(xué)試劑廠；福林-酚：北京索萊寶生物科技有限公司；三氯乙酸、冰乙酸、乙酸鈉：重慶北碚精細(xì)化工廠；磷酸氫二鉀：成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純。

分離培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，營養(yǎng)瓊脂15～20 g加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：干酪素10.0 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：麩皮20g，蒸餾水20mL，121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設(shè)備

JJ-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；THZ-92B臺式恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器、BMJ-250C微生物培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；FA1004電子天平：上海箐海儀器有限公司；BM1000生物顯微鏡：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；GT10-1型離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；PTC-100 PCR儀器：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1功能細(xì)菌的分離、純化

在無菌條件下稱取成品樣品大曲10 g，加入已滅菌的生理鹽水90 mL，混勻制備成菌懸液。再從中取菌懸液1mL加入無菌生理鹽水，以10倍為稀釋單位，逐次稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，從不同稀釋倍數(shù)的菌懸液中取0.2 mL涂布接種于平皿上，其中10-4和10-7倍各做3個(gè)平行，10-5和10-6倍各做5個(gè)平行，35℃倒置培養(yǎng)1 d［6］。將平皿上長勢良好且菌落形態(tài)上有較大差異的細(xì)菌采用平板劃線法將其純化，然后接入固體斜面培養(yǎng)基上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌初篩

將以上分離得到的菌株做透明圈實(shí)驗(yàn)，以透明圈作為考察指標(biāo)進(jìn)行初篩。從固體斜面培養(yǎng)基上將細(xì)菌轉(zhuǎn)接至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上活化，然后將這些菌株以點(diǎn)接法接種到酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)1 d后觀察透明圈大小，并用直尺測量透明圈直徑D（mm）和菌落直徑d（mm）的比值（D/d），選出能產(chǎn)生較大透明圈的菌株。

1.3.3產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌復(fù)篩

模擬生產(chǎn)發(fā)酵工藝，將篩選出的能產(chǎn)生較大透明圈的菌株進(jìn)行復(fù)篩，做菌種產(chǎn)蛋白酶性能試驗(yàn)。先將菌株接到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，35℃倒置培養(yǎng)24 h后，然后從平板上的單菌落挑取一環(huán)移至液體培養(yǎng)基中，35℃搖床培養(yǎng)24 h制備成菌懸液。以10%的接種量將菌懸液加到固體培養(yǎng)基中。按照35℃、45℃、55℃24 h梯度升溫靜置培養(yǎng)3 d［7］。稱取10 g固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物于250 mL三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，40℃水浴鍋中水浴1 h，其中每隔15 min攪拌一次，經(jīng)濾紙過濾后獲得粗酶液。分別配制pH 3.0的乙酸乙酸鈉緩沖液和pH 7.2的磷酸緩沖液，測定其酸性和中性蛋白酶。

1.3.4蛋白酶活力測定

采用福林-酚法測蛋白酶活力，具體操作步驟參見商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白酶活力定義：在40℃條件下，每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)蛋白酶活性單位（U/g）。蛋白酶活力計(jì)算公式如下：

式中：A為由樣品測得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)，μg；4為4 mL反應(yīng)液取出1 mL測定；N為酶液稀釋的倍數(shù)；10為反應(yīng)時(shí)間，min；W為樣品水分百分含量，%。

1.3.5高產(chǎn)蛋白酶菌株的鑒定

（1）菌株形態(tài)學(xué)觀察

將高產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌在平板上活化，再以點(diǎn)接法接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，觀察其單菌落形態(tài)。革蘭氏染色顯微鏡觀察其菌體形態(tài)。

（2）生理生化試驗(yàn)

按《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）［8］及《一般細(xì)菌常用鑒定方法》［9］對細(xì)菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

（3）分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書，采用細(xì)菌16S rDNA通用PCR引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增［13］，在25.0 μL PCR反應(yīng)體系中，加上、下游引物1492r和27f各1.0 μL，Mix 12.5 μL，細(xì)菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為初始變性94℃、5 min，然后變性94℃、0.5 min，退火55℃、0.5 min，復(fù)性72℃、1.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃、10 min。取2 μL DNA溶液于1%瓊脂糖凝膠100 V電泳40 min左右。

測序由上海生物工程有限公司完成，采用16S rDNA測序方法對菌株進(jìn)行分子鑒定。所得測序結(jié)果輸入美國國家生物信息技術(shù)中心（National Center of Biotechnology Information NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，用Neighbor-Joining構(gòu)建目標(biāo)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1功能細(xì)菌的分離

通過平板稀釋涂布法，從醬香大曲中分離得到18株菌落形態(tài)上有較大差異的細(xì)菌。

2.2功能細(xì)菌的篩選

2.2.1產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌初篩

觀察由點(diǎn)接法接種的酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，不同菌種在培養(yǎng)基上出現(xiàn)了大小不一的透明圈，其中有7株透明圈較大，測得其HC值，結(jié)果如表1所示。

表1　透明圈HC值Table 1 HC value of the transparent circle

由表1可知，F(xiàn)BKL1.0199菌株透明圈與菌落直徑比值最大，說明其對培養(yǎng)基中干酪素的分解利用能力較強(qiáng)，即產(chǎn)生蛋白酶的活力較高。對以上菌株進(jìn)行復(fù)篩，以準(zhǔn)確測定其所產(chǎn)蛋白酶活力。

2.2.2產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌復(fù)篩

以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，酪氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine

由圖1可知，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.009 2x+ 0.006 4，相關(guān)系數(shù)R為0.996 6，表明二者線性關(guān)系良好。

將初篩得到的7株細(xì)菌制備成菌懸液，以10%的接種量加入到固體培養(yǎng)基中，模擬大曲生產(chǎn)發(fā)酵工藝，培養(yǎng)3 d后取其發(fā)酵產(chǎn)物用福林-酚法測定其中性和酸性蛋白酶。其結(jié)果分別如表2和表3所示。

由表2和表3可以看出，產(chǎn)中性蛋白酶最高的是FBKL 1.0199，其蛋白酶活力高達(dá)3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相對較高，達(dá)139.27 U/g。產(chǎn)酸性蛋白酶最高的是FBKL 1.0191，蛋白酶活力為189.07 U/g，但其中性蛋白酶酶活較低，僅為90.94 U/g。綜合以上結(jié)果，F(xiàn)BKL 1.0199菌株具有高產(chǎn)蛋白酶的特性，選擇FBKL 1.0199進(jìn)行種屬鑒定。

表2　中性蛋白酶活力測定結(jié)果Table 2 Determination results of neutral protease activities

表3　酸性蛋白活力測定結(jié)果Table 3 Determination results of acid protease activities

2.2.3高產(chǎn)蛋白酶菌株鑒定

（1）菌株形態(tài)學(xué)觀察

對篩選出的FBKL1.0199以點(diǎn)接法接種進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，F(xiàn)BKL1.0199菌株菌落顏色為灰白色，中間有微黃小環(huán)，菌落呈圓形，微微凸起，邊緣為鞭毛狀，干燥無光澤。革蘭氏染色菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞形態(tài)為桿狀。

圖2　FBKL1.0199的菌落形態(tài)（A）和細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.2 Colony morphology（A）and cell morphology（B）of strain FBKL1.0199

（2）生理生化試驗(yàn)

高產(chǎn)蛋白酶菌株FBKL1.0199生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，F(xiàn)BKL1.0199菌株其生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其接觸酶呈陽性，能利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖產(chǎn)酸，可利用檸檬酸鹽，兼性厭氧。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步認(rèn)定FBKL1.0199菌株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），利用分子生物學(xué)手段對其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

表4　FBKL1.0199生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical tests results of strain FBKL1.0199

（3）分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA測序方法對FBKL1.0199菌株進(jìn)行分子鑒定，對DNA進(jìn)行序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可知，PCR擴(kuò)增片段長度約為1 500 bp左右。將所得測序結(jié)果輸入NCBI中進(jìn)行BLAST比對，用Neighbor-Joining法構(gòu)建目標(biāo)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4，根據(jù)比對結(jié)果FBKL1.0199與地衣芽孢桿菌相似性達(dá)到99%，結(jié)合菌落形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)，將其鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

圖3　FBKL1.0199PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis pattern of PCR amplification products of strain FBKL1.0199

圖4　FBKL1.0199系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain FBKL1.0199

3　結(jié)論

采用平板稀釋涂布法分離純化，篩選獲得了一株高產(chǎn)蛋白酶的地衣芽孢桿菌FBKL1.0199，模擬醬香型大曲生產(chǎn)發(fā)酵工藝，通過梯度升溫發(fā)酵，其所產(chǎn)的中性蛋白酶活力高達(dá)3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力達(dá)139.27 U/g。同時(shí)，其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物具有明顯的醬香氣味，這說明了其對于醬香型酒風(fēng)格的形成具有重大作用。

綜上所述，篩選得到的地衣芽孢桿菌FBKL1.0199對醬香型白酒的生產(chǎn)有重要意義，進(jìn)一步研究FBKL1.0199固態(tài)發(fā)酵時(shí)的代謝情況，探究其代謝產(chǎn)物與醬香風(fēng)味成分的關(guān)系，為生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)依據(jù)。

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Screening and identification of functional bacteria with high-yield protease from Moutai-flavor Daqu

WANG Jing1，2，WANG Xiaodan1，2，3，LUO Xiaoye1，2，QIU Shuyi1，2，XIAO Bei1，2，ZHANG Xiaolong1，3，HU Penggang1，2*
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.School of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Through separation and purification of bacteria from Moutai-flavor Daqu，strain FBKL1.0199 with high-yield protease was acquired，and after morphology observation，physiological and biochemical experiment，and molecular biology identification，the strain was identified asBacillus licheniformis.Under the experimental conditions，the neutral protease was as high as 3 925.80 U/g，and the acid protease activity reached 139.27 U/g，which laid a foundation for improving the quality of Moutai-flavor liquor.

Moutai-flavor Daqu；high-yield protease；fermentation process；Bacillus licheniformis

TS261.1

A

0254-5071（2015）10-0043-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.010

2015-09-16

貴州省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字［2014］3012）；貴州省科技廳重大專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字［2013］6009號）；科技部科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題（2011BAC06B12）；貴州省科技廳聯(lián)合資金項(xiàng)目（黔科合LH字［2014］7672）

王婧（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

胡鵬剛（1964-），男，教授，本科，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程和現(xiàn)代分離技術(shù)。