劉勝宇，汪　峰，胡元元

（江蘇省徐州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 徐州 221000）

液相阻斷ELISA法與正向間接血凝（IHA）法檢測豬瘟抗體結(jié)果比較

劉勝宇，汪峰，胡元元

（江蘇省徐州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 徐州 221000）

在我國，豬瘟抗體的檢測過程中最為普遍采用的方法主要有正向間接血凝法（IHA）和液相阻斷ELISA兩種方法。這兩種方法由于具有各自的優(yōu)點(diǎn)而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、疫病控制和邊境檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)中被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)分別采用正向間接血凝法（IHA）和液相阻斷ELISA方法對(duì)相同樣品進(jìn)行豬瘟抗體檢測，對(duì)兩種方法的符合度和差異性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示兩種方法檢測結(jié)果存在一定差異。在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇合適的檢測方法。

IHA；ELISA；抗體檢測

由于豬瘟病毒（CSFV）具有的很強(qiáng)的致病力且感染豬群死亡率高，已經(jīng)給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，世界各國都十分重視對(duì)該病的研究。在血清學(xué)診斷方面相繼建立了多種方法進(jìn)行豬瘟的診斷。其中主要有以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光抗體血清中和技術(shù)（FASN test）等方法。其中目前國際貿(mào)易中主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）包括阻斷法和間接法。目前在我國，對(duì)豬瘟抗體的檢測除采用ELISA方法外，在生產(chǎn)實(shí)踐中，正向間接血凝（IHA）法是一種被廣泛采用的方法。相對(duì)于ELISA方法，正向間接血凝（IHA）法具有成本低、試驗(yàn)簡便容易操作、不需要專門的儀器等優(yōu)點(diǎn)，所以正向間接血凝（IHA）法是很多中小型養(yǎng)殖場進(jìn)行豬瘟抗體的檢測的首選方法。本試驗(yàn)采用兩種不同方法對(duì)相同的血清樣本進(jìn)行了豬瘟抗體的檢測，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的比較。

1　材料與方法

1.1原料與試劑

豬瘟病毒抗體檢測試劑盒（阻斷ELISA）購自北京愛德士元亨生物科技有限公司（美國IDEXX公司生產(chǎn)，試劑盒批號(hào)43200.Q651）。豬瘟正向間接血凝診斷抗原及稀釋液、豬瘟陽性血清、陰性血清均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)為100605、100603和100712

檢測樣本選自江蘇某養(yǎng)殖場的二元雜交豬。

1.2試驗(yàn)儀器

ST-360型酶標(biāo)儀，上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GENIUS 6K-M型臺(tái)式離心機(jī)，長沙市鑫奧儀器儀表有限公司；WZ-2A型微量振蕩器，北京海淀電子醫(yī)療器械儀器廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1阻斷ELISA法檢測豬瘟抗體

1.3.1.1操作步驟試劑盒在使用前，分別將各組分搖勻，18～25℃下放置30min以上以恢復(fù)試劑溫度。

（1）在反應(yīng)板上各空分別加入50μL樣品稀釋液。

（2）分別加入50μL的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，對(duì)照要做雙份。

（3）將被檢樣品分別加入其余的檢測孔，50μL/孔，為防止交叉污染，不同樣本應(yīng)更換滴頭。

（4）將反應(yīng)板用振蕩器振蕩，以混勻溶液。

（5）封條封閉微量反應(yīng)板，20℃溫箱中孵育2h。

（6）以300μL/孔的量，用洗液清洗微量反應(yīng)板，每孔3次，清洗后在吸水紙上扣板，甩去多余液體。

（7）以100μL/孔的量在各孔中加入抗CSFV酶標(biāo)抗體，封條封閉微量反應(yīng)板，20℃溫箱中孵育30min。（加樣前要確保板空未完全干涸，CSFV酶標(biāo)抗體需即取即用）

（8）重復(fù)步驟6的清洗步驟。

（9）以100μL/孔的量在各孔中加入底物溶液，在20℃避光的溫箱孵育10min。（以加完第一孔后開始計(jì)時(shí)）

（10）以100μL/孔的量在各孔中加入100μL的硫酸終止液終止反應(yīng)，終止反應(yīng)的順序要與加入底物的加樣順序保持一致。

（11）在酶標(biāo)儀上檢測各孔在450nm處的吸光度值。

1.3.1.2計(jì)算方法和判定標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照平均值=（陰性對(duì)照1OD450值+陰性對(duì)照2OD450值）/2

陽性對(duì)照平均值=（陽性對(duì)照1OD450值+陽性對(duì)照2OD450值）/2

樣本阻斷率=（陰性對(duì)照平均OD450值-樣品OD450值）/陰性對(duì)照平均OD450值×100%

只有當(dāng)陽性對(duì)照的阻斷率大于50%且陰性對(duì)照的平均OD450值大于0.50，實(shí)驗(yàn)方成立，否則應(yīng)重新檢測。若樣本的阻斷率小于或等于30%，判為陰性（無抗CSFV抗體）；如果被檢樣本的阻斷率在30%～40%之間，該樣本可判為可疑；若樣本的阻斷率大于或等于40%，判為陽性（存在CSFV抗體）。

1.3.2用IHA法檢測豬瘟抗體

1.3.2.1操作步驟

（1）在血凝板上加入稀釋液，50μL/孔。

（2）在第1排第1孔，加入1號(hào)待檢血清50μL，并將槍頭插入孔底，混勻，然后從該孔吸取50μL混勻后的液體，移入第2孔內(nèi)，再混勻后吸取50μL混合液移入第3孔，……按照此規(guī)律一直倍比稀釋至第9孔混勻，然后吸出50μL棄去。此時(shí)該待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）依次為1: 2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512（分別對(duì)應(yīng)第一排1～9孔）。

取2號(hào)待檢血清加入第2排；取3號(hào)待檢血清加入第3排……均按上述方法進(jìn)行稀釋。

（3）其他待檢測血清及陰、陽性對(duì)照血清均按照上述方法進(jìn)行稀釋。

（4）留好稀釋液對(duì)照孔

（5）被檢血清孔、陰性、陽性對(duì)照孔和稀釋液對(duì)照孔，分別加入25μL血凝抗原（使用前血凝抗原要充恢復(fù)室溫并充分搖勻，保證瓶底要無血球沉淀）。

（6）將血凝板置于微量振蕩器上振蕩1～2min，用白紙襯在血凝板下方觀察各孔紅血球是否和混勻，確保沒有血球沉淀。蓋上玻板，室溫過夜，次日判定結(jié)果。

1.3.2.2判定方法將玻璃板移開，用白紙襯在血凝板下方觀察稀釋液對(duì)照孔和1：16陰性對(duì)照孔。血球均應(yīng)全部沉于孔底形成邊緣整齊的小圓點(diǎn)（無凝集），或僅出現(xiàn)血球大部分沉于孔底，邊緣稍有少量血球懸?。ā?”凝集）。

陽性對(duì)照血清1～8孔（1：2～1：256）應(yīng)僅有少量血球沉于孔底，大部分血球懸浮于孔內(nèi)（“++-++++”凝集）為合格。如以上對(duì)照不成立，則實(shí)驗(yàn)方無效，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。當(dāng)對(duì)照孔合格時(shí)，再觀察檢測孔，待檢血清以呈現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。當(dāng)稀釋倍數(shù)大于或等于1: 16時(shí)判為豬瘟抗體陽性。

2　結(jié)果與分析

2.1采用兩種不同方法分別檢測同一批樣品中豬瘟抗體水平

分別采用兩種方法對(duì)同一批，共計(jì)350份血清進(jìn)行檢測。采用液相阻斷ELISA法檢測出陽性樣品206份，總陽性率為58.9%；采用正向間接血凝法（IHA）檢測出陽性樣品267份，總陽性率為76.3%。

表1　兩種不同方法分別檢測同一批樣品的檢測結(jié)果

2.2兩種方法檢測同一批樣品，檢測結(jié)果的符合度及相關(guān)性

分別采用液相阻斷ELISA法和正向間接血凝法（IHA）檢測同一批共計(jì)350份樣品的豬瘟抗體水平，結(jié)果如表2、表3所示，兩者總體符合率為68.3%。采用卡方檢驗(yàn)，對(duì)兩種方法的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)如表4，發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測結(jié)果存在差異。（x2=32.4，p＜0.01）

表2　正向間接血凝法（IHA）與液相阻斷ELISA法檢測結(jié)果的符合情況

表3　 液相阻斷ELISA法與正向間接血凝法（IHA）檢測結(jié)果的符合情況

表4　兩種不同方法分別檢測同一批樣品的檢測結(jié)果相關(guān)性

3　討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法檢測結(jié)果存在一定的差異。經(jīng)液相阻斷ELISA法檢測呈陽性的樣品，再采用正向間接血凝的方法檢測其結(jié)果多為陽性。（兩者符合率為87.9%）；而經(jīng)正向間接血凝的方法檢測呈陽性的樣品，再采用液相阻斷ELISA法檢測，兩者符合率不高（其結(jié)果符合率僅為67.7%）。兩種方法檢測豬瘟抗體總符合率為68.3%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩種方法存在差異。造成其結(jié)果差異的因素很多，在進(jìn)行正向間接血凝法檢測時(shí)，采用人工稀釋和讀數(shù)的過程會(huì)產(chǎn)生較大的誤差，IHA診斷試劑中，紅細(xì)胞來源、致敏技術(shù)、血清中雜質(zhì)、其他病原微生物污染等因素也會(huì)引起反應(yīng)的失敗或產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。另外，豬瘟正向間接血凝方法檢測的是血清中的全病毒抗體，由于牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）與豬瘟病毒擁有相同的糖蛋白抗原，所以存在血清學(xué)的交叉反應(yīng)。而液相阻斷ELISA方法僅測E2蛋白產(chǎn)生的抗體。有資料顯示液相阻斷ELISA法檢測到的抗體與中和抗體具有高度的正相關(guān)性，在一定的抗體區(qū)間內(nèi)可以用阻斷率的高低來估測豬群的保護(hù)性抗體水平，并與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）沒有交叉反應(yīng)。相對(duì)而言，正向間接血凝法不具備上述優(yōu)勢。但正向間接血凝法具有試劑價(jià)格低廉、操作方法簡便、不需要專門儀器等優(yōu)點(diǎn)，更適用于中小型豬場了解掌握豬瘟免疫情況。兩種方法各自具有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢，所以在生產(chǎn)實(shí)踐中，要結(jié)合實(shí)際情況來選擇適合的檢測方法。

從略）

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.020

劉勝宇（1982～），遼寧省遼陽市人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物傳染病的預(yù)防和控制工作