徐智云 劉鑫 黃興 楊德琴

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科·口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400017

牙齒發(fā)育是一種復(fù)雜的生理過程，主要通過上皮和間充質(zhì)間的相互作用完成，期間涉及多種生長因子和信號途徑，在特定的時空調(diào)控下共同作用最終成形。細(xì)胞間隙連接蛋白43（connexin 43，cx43）直接調(diào)控細(xì)胞間的連接通訊，進(jìn)行信息和能量的傳遞，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝和增殖分化等一系列生理過程[1]，在脊椎動物早期的心血管發(fā)育[2]、神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)[3]、骨骼形成和礦化[4]中發(fā)揮重要作用，同時與心血管系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，cx43基因在小鼠牙齒發(fā)育成形過程中高表達(dá)，參與牙齒發(fā)育，并且在牙齒礦化過程中發(fā)揮重要作用。cx43基因缺陷與人類常染色體顯性遺傳病眼-牙-指綜合征（oculoden-todigital dysplasia，ODDD）相關(guān)，呈現(xiàn)并指、釉質(zhì)發(fā)育不全和（或）顱面部畸形等表型[8]。目前cx43基因在牙齒發(fā)育和礦化過程中的具體功能尚不清楚。

斑馬魚是一種公認(rèn)的用于研究器官形成和發(fā)育相關(guān)分子生物學(xué)機制的理想模式生物，因其同哺乳動物高度的基因同源性而被廣泛運用于發(fā)育生物學(xué)的研究[9]。斑馬魚牙齒的發(fā)育和替換很大程度上反映了有牙脊椎動物的原始狀態(tài)[10]。本研究旨在探索cx43基因在斑馬魚牙齒發(fā)育和形成中的作用，為探究牙齒內(nèi)源性再生奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生型（wild type）斑馬魚，由西南大學(xué)分子發(fā)育實驗室購進(jìn)。

1.2 主要試劑及設(shè)備

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性內(nèi)切酶（NEB公司，美國），PCR puri fi cation Kit檢測試劑盒（Qiagen公司，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche公司，美國），RNA提取試劑盒（Life Technologies公司，美國），T4連接酶（Invitrogen公司，美國）。體視解剖顯微鏡（Leica公司，德國），臺式離心機（Eppendorf公司，德國）。

1.3 動物飼養(yǎng)

參照Wester fi eld[11]的方法于28.5 ℃水溫、14 h光照、10 h黑暗的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，按雌雄比例1︰1或1︰2放入交配缸內(nèi)，次日清晨收集斑馬魚受精卵并清洗，置于28.5 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)和胚胎孵育。用于整胚原位雜交的胚胎培養(yǎng)液中需添加0.04%的1-苯基-2-硫脲（phenylthiourea，PTU）孵育。

1.4 cx43反義探針的制備

收集野生型斑馬魚受精后72 h的胚胎，用Trizol法提取總RNA，運用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測完整性及純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。根?jù)斑馬魚cDNA文庫中cx43基因序列設(shè)計引物，探針正向引物：5’-ACTCCCTCAAGAXXXXXGACT-3’，反向引物：5’-CTAGCGTTGGGXXXXXGCAT-3’，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。連接PCR產(chǎn)物于PGEMT載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)菌株中進(jìn)行克隆，篩選氨芐抗性陽性質(zhì)粒。用EcoRⅠ酶或NotⅠ酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，通過測序鑒定判斷插入片段連接方向。取正確的重組質(zhì)粒單一酶切位點線性化，電泳鑒定線性化徹底后回收。電泳判斷濃度，用SP6或T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄模板，同時加入地高辛標(biāo)記的寡核苷酸，轉(zhuǎn)錄后用DnaseⅠ酶消化多余的DNA骨架，產(chǎn)物經(jīng)LiCl純化后得到地高辛標(biāo)記的cx43基因反義mRNA探針，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量并測量濃度，-20 ℃保存。

1.5 斑馬魚全時相胚胎原位雜交

運用整胚原位雜交技術(shù)檢測斑馬魚胚胎發(fā)育早期cx43基因在牙齒發(fā)育部位的表達(dá)分布。收集受精后48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h、132 h、6 d、7 d、8 d、9 d不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎，4%多聚甲醛4 ℃過夜固定，甲醇梯度脫水至胚胎透明，-20 ℃、100%甲醇溶液中保存?zhèn)溆?。?天，1×PBST梯度孵育復(fù)水，用5 μg·mL-1蛋白酶K消化[12]并4%多聚甲醛再固定后移入68 ℃雜交爐中預(yù)雜交2～5 h，地高辛標(biāo)記的cx43 RNA探針預(yù)變性處理后，加入胚胎中65 ℃雜交過夜。第2天，首先2×SSCT梯度逐步洗去多余非特異性結(jié)合探針，然后室溫下梯度過度到馬來酸緩沖液（Maleic acid buffer，MABT），用1×封閉緩沖液（1×blocking）胚胎封閉2 h。最后加入1︰2 000稀釋的anti-DIG-AP封閉液與cx43基因反義mRNA探針在4 ℃下結(jié)合過夜。第3天，室溫下用MABT清洗直至洗凈，嚴(yán)格避光，NTMT平衡液中按1︰50加入顯色液5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）/硝基四氮唑藍(lán)（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）溶液顯色20 min，顯微鏡下觀察顯色成功（出現(xiàn)棕褐色雜交信號）后終止染色，記錄結(jié)果并進(jìn)行分析。

1.6 茜素紅染色

取受精后9 d斑馬魚適量，放置于MS-222溶液（100 mg·L-1）中麻醉致死，用4%多聚甲醛固定2 h后50%乙醇脫水10 min；去除乙醇加入0.5%茜素紅染液染色過夜；純水漂洗后用現(xiàn)配的1.5%雙氧水和1%氫氧化鉀混合液漂白20 min，經(jīng)0.5%KOH和甘油混合液梯度透明，保存于純甘油中[13]，比較cx43原位雜交表達(dá)區(qū)域與咽齒解剖部位的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 cx43反義探針的制備

通過PCR擴增獲得的特異性條帶，片段大小約1 179 bp（圖1），長度符合預(yù)期。將PCR片段連接于PGEMT載體上，對重組質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切驗證（圖2），正確的重組質(zhì)?？稍贓coRⅠ酶的作用下切出3 kb骨架和1 179 bp插入片段。7個待驗證質(zhì)粒中除1個外余皆可切出相應(yīng)片段，為正確的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒PGEMT-cx43構(gòu)建成功。取正確的重組質(zhì)粒，判斷片段連接方向為反向，用SalⅠ在SP6方向切開線性化重組質(zhì)粒，選用T7 RNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄獲得cx43基因反義mRNA探針。

圖1 PCR結(jié)果Fig 1 PCR results

2.2 茜素紅染色結(jié)果

茜素紅染色結(jié)果表明，受精后9 d時cx43原位雜交表達(dá)部位與咽齒解剖部位基本重疊一致（圖3），說明cx43基因表達(dá)于發(fā)育中的咽齒，而對已經(jīng)礦化完全的咽齒不發(fā)揮作用。

2.3 斑馬魚全時相胚胎原位雜交結(jié)果

原位雜交結(jié)果表明，cx43基因在斑馬魚受精后各個時期咽弓牙齒相應(yīng)部位均可見到強棕褐色陽性信號，除此以外中樞神經(jīng)系統(tǒng)、頭部、眼睛以及胰腺等部位也可檢測到陽性信號（圖4）。

圖2 重組質(zhì)粒EcoRⅠ酶切驗證Fig 2 Restriction enzyme digestion of recombination plasmid with EcoRⅠ

圖3 cx43基因表達(dá)部位與咽齒解剖部位 茜素紅染色 × 50Fig 3 cx43 gene expression and anatomical of pharyngeal teeth ali-zarin red stain × 50

圖4 cx43基因48 h～9 d的斑馬魚胚胎 原位雜交 × 50Fig 4 cx43 gene from 48 h to 9 d embryo of Zebra fi sh in situ hybridization × 50

在斑馬魚牙齒發(fā)育起始點受精后48 h，cx43少量表達(dá)于眼睛、前腎以及神經(jīng)中樞（圖4A）；60 h時檢測到cx43在牙齒相應(yīng)部位開始表達(dá)，同時神經(jīng)中樞表達(dá)增強，背側(cè)觀棕褐色信號以中線為軸左右對稱，位于頭部稍下最后咽弓處（圖4B），左側(cè)位觀表達(dá)位于心臟斜上方，部位與咽齒的解剖部位相重疊。72 h時可見cx43信號表達(dá)量較之前明顯上升，背側(cè)觀信號增強明顯（圖4C）；84 h時出現(xiàn)回落，表達(dá)量逐漸降低（圖4D）；96 h時開始一側(cè)由一整個信號點逐漸分為2個，部分兩信號間區(qū)分不明顯（圖4E）；108 h單側(cè)2個等大信號較前一時相更為獨立清晰（圖4F）；120 h時單側(cè)信號點由2個向3個轉(zhuǎn)換（圖4G）；132 h時呈現(xiàn)單側(cè)3個清晰的信號點且左右表型不對稱（圖4H）；6 d時表達(dá)量明顯減弱（圖4I）；7 d時維持一個較弱的表達(dá)（圖4J）；8 d時表達(dá)略增強，呈中間大兩邊小3個點（圖4K）或一大一小2個點；9 d時單側(cè)出現(xiàn)兩個等大的弱信號（圖4L）。

3 討論

目前國內(nèi)外學(xué)者多以小鼠、小型豬等作為研究牙發(fā)育的首選，然而這些模式生物由于自身的局限性，對于基因表達(dá)的動態(tài)追蹤定位、信號間相互傳導(dǎo)的級聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析等相關(guān)研究存在極大困難，不能夠準(zhǔn)確獲得基因表達(dá)時間、空間與具體發(fā)育過程之間的相互聯(lián)系。斑馬魚雖為原始脊椎動物，但與人類具有高度的基因同源性和相似的分子機制，具有研究的前瞻價值[14]。斑馬魚的優(yōu)勢除了體積小、易于飼養(yǎng)與繁殖、成熟周期短，能夠快速獲得大量個體以外，同時具有體外發(fā)育、早期胚體透明等特點，借助一些特殊的實驗技術(shù)和實驗手段，易于追蹤觀察，獲取直觀信息，為研究分子機制提供了可操作性。這是本研究選用斑馬魚為模式生物的原因。

斑馬魚缺乏口齒但存在發(fā)育礦化良好的咽齒，咽齒局限于第五鰓弓處，其牙為端生牙、同形牙、多牙列。咽齒無論在基本組成結(jié)構(gòu)還是發(fā)育過程上都與哺乳動物具有極強的相似性[15]。礦化程度和Ca、P比例亦與哺乳動物具有一定程度的相似性[16]。咽齒的特異性在于存在部位特殊和缺乏牙根[17]，但這不影響早期牙胚發(fā)育過程的研究。斑馬魚是研究人類牙齒形態(tài)特征、組織結(jié)構(gòu)和生物礦化過程的理想模式動物。斑馬魚牙齒分為腹（V）、中（MD）、背（D）側(cè)3組，最早發(fā)育的牙齒4V1在胚胎受精后48 h即開始形成，在4 d時完全礦化及附著于牙槽骨上[18]。3V1和5V1在受精后56 h時同時出現(xiàn)在4V1兩側(cè)，并在6 d時發(fā)育完善及附著于牙槽骨上[20]。最早替換的牙齒4V2形成于受精后80 h，3V2、5V2隨后出現(xiàn)于144 h。4V2、3V2和5V2在受精后12 d完全發(fā)育及附著于牙槽骨上[19]。

本研究整胚原位雜交結(jié)果表明，cx43在斑馬魚牙齒發(fā)育過程中發(fā)揮作用。初代牙齒期：雖然4V1在受精后48 h開始形成，但cx43無表達(dá)，此時牙處于鐘狀期尚未礦化。60 h時4V1進(jìn)入晚期細(xì)胞分化期，cx43基因參與其中并開始表達(dá)于牙齒發(fā)育部位。72 h時3V1和5V1由早期細(xì)胞向晚期細(xì)胞分化，cx43表達(dá)量上升迅速，84 h時可見cx43表達(dá)量有所減低。由此可推測cx43在細(xì)胞分化晚期至附著初期發(fā)揮作用，即在礦化階段發(fā)揮功能。3V1、5V1從72 h到120 h一直處于晚期細(xì)胞分化階段，從96 h開始隨著3V1、5V1發(fā)育的進(jìn)行，單側(cè)逐漸出現(xiàn)兩個高表達(dá)點（3V1，5V1），兩個表達(dá)信號之間起初較為接近，至108 h時逐漸獨立清晰，表達(dá)信號左右對稱等大。發(fā)育替換期：最早的替換牙齒4V2形成于80 h，而3V2、5V2形成于6 d。既往的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚替換牙齒與初代牙齒發(fā)育分子信號機制存在差異，發(fā)育時間有所延長。初代牙齒一般2～4 d即可完成發(fā)育，而替換的牙齒發(fā)育時間多延長到8 d左右[20]。因此可以推論，替換的牙齒發(fā)育礦化的時間也相應(yīng)推后。從cx43在相應(yīng)部位的表達(dá)檢測可以發(fā)現(xiàn)，120 h時4V2開始礦化，此時兩個信號點（3V1、5V1）向3個信號點（4V2、3V1、5V1）轉(zhuǎn)化，132 h時基本兩側(cè)呈現(xiàn)3個信號點（4V2、3V1、5V1）且兩邊稍大，中間略小。6 d時3V1、5V1礦化完成，cx43相應(yīng)部位表達(dá)結(jié)束，原位雜交結(jié)果符合預(yù)期。6、7 d時cx43表達(dá)呈單側(cè)單一信號（4V2），8 d時4V2、3V2及5V2同時處于細(xì)胞分化礦化期，呈現(xiàn)中間大兩邊小3個信號點（4V2、3V2、5V2）。9 d時4V2礦化完成，3V2、5V2繼續(xù)直至12 d完成附著。cx43表達(dá)模式同牙齒礦化階段吻合，且主要表達(dá)于礦化晚期。這可初步認(rèn)為cx43在牙齒細(xì)胞分化晚期發(fā)揮作用，參與礦化。此外從cx43信號的表達(dá)量上，亦可以看出初代牙齒與替換牙齒之間存在差異。這種差異可能與干細(xì)胞在初代牙齒形成過程中的集聚現(xiàn)象有關(guān)。

關(guān)于cx43在牙齒發(fā)育中的作用，最早Pinero等[21]用受精后1 d的小鼠進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色方法發(fā)現(xiàn)cx43在新生鼠的口腔成釉上皮層、成牙本質(zhì)細(xì)胞層及牙槽骨處均有表達(dá)，且表達(dá)廣泛存在于內(nèi)釉上皮、中間層和成牙本質(zhì)細(xì)胞區(qū)域。這說明cx43與牙的形成相關(guān)。Jo?o等[7]運用激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)cx43基因參與成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的早期分化。Toth等[22]運用ODDD小鼠模型證明了cx43表達(dá)水平的降低是成釉細(xì)胞發(fā)育失常、釉質(zhì)發(fā)育不全的主要原因。這說明cx43同時參與了釉質(zhì)的形成。本實驗運用斑馬魚整胚原位雜交技術(shù)對基因表達(dá)部位進(jìn)行連續(xù)動態(tài)檢測，證實了cx43參與牙齒的礦化過程，并且主要作用于礦化晚期階段。

牙的發(fā)育和形成過程涉及多種基因共同參與形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，根據(jù)原位雜交數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，cx43在斑馬魚牙齒發(fā)生部位和礦化階段高表達(dá)，說明cx43參與牙齒發(fā)育礦化的過程，然而cx43基因調(diào)控牙齒發(fā)育的機制及與牙本質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)性的研究尚屬探索階段，因此本實驗運用斑馬魚為模式生物，通過原位雜交技術(shù)探究cx43基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)，結(jié)果表明cx43基因參與了牙齒的發(fā)育和分化，且主要作用于礦化晚期階段。

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