劉曉娟，陳元紅，劉亞，胡啟迪，任湘鵬

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室中心，浙江 溫州 325027）

氯化鎘對(duì)ZR75-1細(xì)胞DNA錯(cuò)配修復(fù)活性的抑制效應(yīng)

劉曉娟1，陳元紅1，劉亞2，胡啟迪2，任湘鵬2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室中心，浙江 溫州 325027）

目的：研究氯化鎘（CdCl2）暴露對(duì)人乳腺癌細(xì)胞ZR75-1 DNA錯(cuò)配修復(fù)（DNA MMR）活性的影響。方法：用0、10、20、30、40、50 μmol/L的CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞染毒48 h和72 h后，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法檢測(cè)各組ZR75-1細(xì)胞的存活率。以5、10、15 μmol/L的CdCl2分別作用于ZR75-1細(xì)胞48 h后，各組平行轉(zhuǎn)染同源、異源質(zhì)粒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相對(duì)熒光表達(dá)率來評(píng)估各組ZR75-1細(xì)胞的DNA MMR活性；同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CdCl2暴露后DNA MMR活性相關(guān)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10、20 μmol/L CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞的存活率無顯著影響（P＞0.05），而30、40、50 μmol/L CdCl2對(duì)細(xì)胞有顯著毒性作用（P＜0.05），且表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，5、10、15 μmol/L CdCl2暴露均顯著降低了ZR75-1細(xì)胞的DNA MMR活性（P＜0.05）。熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，5、10、15 μmol/L CdCl2處理組中MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 mRNA表達(dá)水平總體上升，變化趨勢(shì)均為隨CdCl2暴露濃度增加先上升后下降。結(jié)論：對(duì)細(xì)胞存活率無影響的CdCl2暴露可顯著抑制ZR75-1細(xì)胞的DNA MMR活性，并上調(diào)DNA MMR活性相關(guān)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 mRNA的表達(dá)水平。

氯化鎘；ZR75-1細(xì)胞；DNA錯(cuò)配修復(fù)

鎘元素是一種生物蓄積性強(qiáng)、毒性持久、具有典型“三致”效應(yīng)的劇毒重金屬，氯化鎘（CdCl2）是一種廣泛應(yīng)用于工業(yè)中的毒性較高的鎘化合物。近年來鎘污染對(duì)人體健康的危害已成為全世界重要的公共衛(wèi)生學(xué)問題，研究證實(shí)鎘與人類的多種癌癥有關(guān)聯(lián)［1］，國際癌癥研究協(xié)會(huì)（IARC）將其列為第1類致癌物。有研究表明，鎘致癌的可能途徑之一是通過干擾機(jī)體DNA錯(cuò)配修復(fù)（DNA mismatch repair，DNA MMR）系統(tǒng)的功能［2］。DNA MMR系統(tǒng)廣泛存在于從原核到真核生物體中，是細(xì)胞DNA復(fù)制后的一種修復(fù)機(jī)制，它能夠有效保證DNA復(fù)制的保真度，維持基因組的穩(wěn)定性，DNA MMR系統(tǒng)活性的受損與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)研究采用了一種直接對(duì)活細(xì)胞DNA MMR活性進(jìn)行定量分析的模型［4］，該模型利用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因作為報(bào)告基因，構(gòu)建一對(duì)EGFP基因真核表達(dá)質(zhì)粒，包括一個(gè)可直接表達(dá)綠色熒光的同源質(zhì)粒，在另一個(gè)異源質(zhì)粒EGFP基因的啟動(dòng)子處引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，只有經(jīng)過轉(zhuǎn)染細(xì)胞，依靠細(xì)胞的DNA MMR系統(tǒng)修復(fù)后才能表達(dá)綠色熒光。通過檢測(cè)異源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與同源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組之間的相對(duì)熒光表達(dá)率，即可定量評(píng)估細(xì)胞DNA錯(cuò)配修復(fù)活性。利用該模型，本實(shí)驗(yàn)研究了不同劑量的CdCl2染毒處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞ZR75-1 DNA MMR活性的影響，以期明確CdCl2是否可直接干擾細(xì)胞的DNA MMR活性。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株、質(zhì)粒及菌株：乳腺癌細(xì)胞ZR75-1、紅色熒光蛋白（RFP）表達(dá)質(zhì)粒、EGFP表達(dá)質(zhì)粒p111及突變型EGFP表達(dá)質(zhì)粒p189由美國德州大學(xué)健康科學(xué)中心孫魯浙教授饋贈(zèng)，p189質(zhì)粒在EGFP編碼區(qū)第58位引入一個(gè)終止密碼子（TGG58-TAG），不能表達(dá)EGFP?；蚬こ叹鶨.coli DH5α及JM109感受態(tài)菌（碧云天生物科技有限公司）。

1.1.2主要試劑：CdCl2標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%，Sigma公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，純度為98%，Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基、無支原體胎牛血清（美國GIBCO公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），質(zhì)粒大量抽提試劑盒及內(nèi)切酶Mlu I（碧云天生物科技有限公司），輔助噬菌體M13（New England Biolabs公司），Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase（PSAD酶，EPICENTER Biotechnologies公司），Duplex-specific nuclease（DSN酶，俄國Evrogen公司），外切核酸酶ExoI I I及缺刻酶Nb.Bpu10I（德國Fermentas公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.1.3主要設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀及NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Forma公司），5417R臺(tái)式低溫高速離心機(jī)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司），JS-380C凝膠成像系統(tǒng)（上海培清生物科技公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱及細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠），倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）。

1.2方法

1.2.1藥物配置：CdCl2用無菌去離子水配制成濃度為1 000 mmol/L的CdCl2母液，用封口膜密封好后保存于4 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前將CdCl2母液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中震蕩混勻，配制成2倍工作濃度的工作液，即濃度分別為0（對(duì)照組）、20、40、60、80、100 μmol/L。將MTT粉末充分溶解于1×PBS溶液中，配制成2 mg/ mL的MTT溶液，過濾除菌后于4 ℃避光保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及染毒：ZR75-1細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（4 500 mg/L葡萄糖），添加10%胎牛血清，置于37 ℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁密度為80%左右時(shí)，將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50 μL新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入50 μL 2倍濃度的CdCl2工作液，充分混勻，至暴毒終濃度分別為：0（對(duì)照組）、10、20、30、40、50 μmol/L。

1.2.3MTT法測(cè)定ZR75-1細(xì)胞存活率：CdCl2暴毒48 h和72 h后取出96孔板，每孔加入50 μL 2 mg/mL 的MTT溶液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h。用真空抽濾器將孔中液體吸出，每孔加入200 μL DMSO，于震蕩器上振蕩5～10 min，使細(xì)胞生成的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）完全溶解到DMSO中，使用酶標(biāo)儀在570 nm下測(cè)量各孔吸光值。以各組平均吸光度值（OD570）反映細(xì)胞存活及增殖狀態(tài)，OD570值越高，則細(xì)胞數(shù)目越多，活力越高。以各暴毒組吸光度值（OD）/對(duì)照組細(xì)胞吸光度值（OD）×100%作為細(xì)胞的存活率（survival rate）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4同源和異源質(zhì)粒的制備［5-6］：以p111為底物，使用輔助噬菌體M13，用缺刻酶Nb.Bpu10I和外切核酸酶ExoI I I消化，并使用DSN酶純化，回收后得到單鏈環(huán)狀的p111編碼股（“+”鏈）；以p111和p189為底物，用內(nèi)切酶Mlu I酶切，濃縮回收得到線性化質(zhì)粒DNA。將單鏈環(huán)狀的p111（“+”鏈）分別與線性化p111和p189分子按照1.5∶1摩爾比混合退火，形成帶一個(gè)缺刻環(huán)狀的同源和異源雙鏈核酸分子。加入PSAD酶消化，降解去除多余單鏈分子和雙鏈線性分子，純化回收后得到高純度缺刻環(huán)狀的同源和異源質(zhì)粒。在此缺刻型環(huán)狀異源質(zhì)粒EGFP基因的啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)引入的T/G錯(cuò)配。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)ZR75-1細(xì)胞的DNA MMR活性［4］：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ZR75-1細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)基更換成含CdCl2濃度為0、5、10、15 μmol/L的培養(yǎng)基。CdCl2暴毒48 h后，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將等量的同源或異源質(zhì)粒與RFP表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ZR75-1細(xì)胞，RFP表達(dá)質(zhì)粒用來校正同源和異源質(zhì)粒組的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)，用37 ℃預(yù)熱的胰酶處理活細(xì)胞，1 000 r/min離心4 min，棄除上清液，加入1×PBS清洗，用PBS溶解制成單細(xì)胞懸液。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞百分率（% Gated），以及表達(dá)綠色熒光細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（mean）。細(xì)胞的DNA MMR活性大小可由相對(duì)綠色熒光表達(dá)率（relative EGFP expression）來反映，計(jì)算公式為：（異源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組% Gated×mean）/（同源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組% Gated×mean）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Real-time PCR法檢測(cè)ZR75-1細(xì)胞DNA MMR相關(guān)基因的表達(dá)：分別收集經(jīng)5、10、15 μmol/L CdCl2處理48 h后的ZR75-1及對(duì)照組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，溶解于DEPC水。RNA樣品在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察出現(xiàn)清晰集中的28S、18S、5S三條帶，且28S/18S約為2∶1，證實(shí)RNA樣品完整性較好。同時(shí)檢測(cè)OD值，OD260/OD280值均大于1.8，證實(shí)RNA樣品純度較好；測(cè)定并調(diào)整RNA濃度為1 μg/L。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×RT Buffer 4 μL，Reverse Transcriptase 1 μL，Rnase Inhibitor 1 μL，Random Primer 1 μL，RNA 1 μL，Rnase-free Water 12 μL；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25 ℃ 5 min，37 ℃60 min，75 ℃ 5 min，cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存。Real-time PCR引物序列如表1所示，均委托上海生工合成。反應(yīng)體系為：2×mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因每次設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，所有樣品均設(shè)置陰性對(duì)照（無模板）以排除假陽性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用??CT定量方法分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1　Real-time PCR檢測(cè)的基因及引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性者多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞存活率的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果（見表2）顯示，10、20、30、40、50 μmol/L CdCl2暴露48 h和72 h后，與對(duì)照組相比，10、20 μmol/L CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞的活力沒有明顯影響（均P＞0.05）；30、40、50 μmol/L CdCl2對(duì)細(xì)胞有明顯抑制作用，細(xì)胞活力呈現(xiàn)顯著下降（均P＜0.05）。與同濃度CdCl2暴露48 h組相比，40及50 μmol/L CdCl2暴露72 h組ZR75-1細(xì)胞活力均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。可見，CdCl2降低乳腺癌細(xì)胞ZR75-1的生存率呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴方式。

2.2單鏈DNA及同源和異源質(zhì)粒的制備情況 如圖1所示，本實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的單鏈DNA及同源和異源質(zhì)粒。

2.3CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞DNA MMR活性的影響 流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)ZR75-1細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況，如表3所示。與對(duì)照組相比，5、10、15 μmol/L CdCl2暴露后，ZR75-1細(xì)胞的相對(duì)熒光表達(dá)率均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），表明高于5 μmol/L CdCl2暴露濃度可顯著抑制ZR75-1細(xì)胞DNA MMR活性，且抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴方式。10、15 μmol/L組細(xì)胞的相對(duì)熒光表達(dá)率大致相當(dāng)。

表2　不同濃度CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞活力及存活率的影響（±s）

表2　不同濃度CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞活力及存活率的影響（±s）

與同一時(shí)間對(duì)照組比：aP＜0.05

72 h OD570　　存活率（%）　OD570　　存活率（%）對(duì)照組　0 μmol/L　0.795±0.025a　100.000　0.934±0.035a　100.000實(shí)驗(yàn)組　10 μmol/L　0.778±0.028a　97.862　0.922±0.044a　98.715 20 μmol/L　0.766±0.027a　96.352　0.916±0.029a　98.073 30 μmol/L　0.692±0.016a　87.044　0.734±0.025a　78.587 40 μmol/L　0.580±0.055a　72.956　0.424±0.010a　45.396 50 μmol/L　0.433±0.026a　54.465　0.230±0.013a　24.625組別　　濃度　48 h

圖1　單鏈DNA及同源和異源質(zhì)粒的制備電泳圖

2.4CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞DNA MMR相關(guān)基因表達(dá)的影響 Real-time PCR法測(cè)定每組樣本中每一個(gè)基因的△Ct值，然后計(jì)算出2-△△Ct（見表4）。結(jié)果表明，用5、10、15 μmol/L CdCl2暴毒ZR75-1細(xì)胞48 h后，隨著暴毒濃度的增加，MMR相關(guān)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1的相對(duì)表達(dá)量均為先上升后略微下降，但整體為上升趨勢(shì)。5 μmol/L CdCl2處理組中，MSH6和PMS1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MLH1和MSH2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平也呈上升趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4個(gè)DNA MMR相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平在10 μmol/L CdCl2處理組中均顯著上調(diào)（均P＜0.05），且達(dá)到最高峰。15 μmol/L CdCl2處理組中，MSH6和PMS1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05）；MLH1 和MSH2基因表達(dá)水平略微變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

DNA MMR系統(tǒng)廣泛存在于生物體中，主要起維持基因組穩(wěn)定的作用，它是繼癌基因與抑癌基因后被確認(rèn)的第三類腫瘤相關(guān)基因，大約70%的人類腫瘤均與DNA MMR基因的突變或缺陷造成的活性降低密切相關(guān)［7-8］。許多環(huán)境中的化學(xué)污染物可直接以DNA MMR基因?yàn)樽饔冒袠?biāo)，使細(xì)胞DNA MMR活性受到干擾甚至喪失，這可能是很多化學(xué)物致癌的共同機(jī)制之一［3］。已有研究表明，鎘致癌的可能途徑之一是通過干擾細(xì)胞DNA MMR系統(tǒng)［2］，鎘暴露可以抑制烷基化損傷后DNA MMR系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯［9］。但是，鎘是否可以直接抑制DNA MMR系統(tǒng)的活力這一關(guān)鍵結(jié)論鮮見報(bào)道。

表3　不同濃度CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞相對(duì)熒光表達(dá)率的影響（±s）

表3　不同濃度CdCl2對(duì)ZR75-1細(xì)胞相對(duì)熒光表達(dá)率的影響（±s）

與同一時(shí)間對(duì)照組比：bP＜0.01

組別　　濃度　　同源質(zhì)粒組　　異源質(zhì)粒組　　相對(duì)熒光表達(dá)率（%）細(xì)胞百分率（%）　　平均熒光強(qiáng)度　　細(xì)胞百分率（%）　　平均熒光強(qiáng)度對(duì)照組　0 μmol/L　1.63±0.06　210.14± 4.39　1.56±0.04　192.93± 6.65　87.70±2.43b實(shí)驗(yàn)組　5 μmol/L　3.31±0.07　305.73±16.48　2.36±0.06　282.51±18.87　65.83±2.18b10 μmol/L　3.42±0.10　261.21±17.29　2.25±0.36　223.35±35.69　55.50±2.91b15 μmol/L　3.21±0.05　295.91± 2.58　2.44±0.06　216.00±13.12　55.47±1.56b

表4　不同濃度CdCl2暴露48 h后ZR75-1細(xì)胞DNA MMR相關(guān)基因mRNA的2-△△Ct（±s）

表4　不同濃度CdCl2暴露48 h后ZR75-1細(xì)胞DNA MMR相關(guān)基因mRNA的2-△△Ct（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　　濃度DNA MMR相關(guān)基因MLH1　MSH2　MSH6　PMS1對(duì)照組　0 μmol/L　1　1　1　1實(shí)驗(yàn)組　5 μmol/L　1.04±0.11b　1.12±0.09b　1.31±0.12a　1.22±0.02a10 μmol/L　1.37±0.20b　1.25±0.08a　1.45±0.15b　1.43±0.03b15 μmol/L　1.11±0.14b　0.98±0.10b　1.28±0.03a　1.21±0.02a

本研究利用美國德州大學(xué)健康科學(xué)中心孫教授研究團(tuán)隊(duì)建立的一種直接定量分析活細(xì)胞DNA MMR活性的模型［4］，研究了不同劑量的CdCl2染毒處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞ZR75-1 DNA MMR活性的影響。結(jié)果表明，對(duì)ZR75-1細(xì)胞生存率無明顯影響的CdCl2暴露濃度（5、10、15 μmol/L）即可對(duì)其DNA MMR活性產(chǎn)生了顯著的抑制效應(yīng)（均P＜0.01），且抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴方式。本研究結(jié)果首次證實(shí)CdCl2可直接抑制活細(xì)胞的DNA MMR活力，為進(jìn)一步確認(rèn)CdCl2通過干擾DNA MMR活性這一致癌機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)佐證。與本研究類似，典型環(huán)境致癌物苯并芘以濃度依賴方式抑制人乳腺癌細(xì)胞的DNA MMR活力，在1、5 μmol/L暴露時(shí)可顯著抑制ZR75-1細(xì)胞的DNA MMR活性［10］。這些研究結(jié)果提示，細(xì)胞DNA MMR活性有可能作為一種敏感特異的生物標(biāo)志物，用于環(huán)境污染物致癌性的快速初篩。

值得注意的是，本研究中對(duì)照組ZR75-1細(xì)胞的相對(duì)熒光表達(dá)率為0.877，小于1（理論上正常細(xì)胞的相對(duì)熒光表達(dá)率為1），這和Chen等［10］報(bào)道的ZR75-1細(xì)胞的DNA MMR活力大小基本一致，可能是因?yàn)閆R75-1本身為腫瘤細(xì)胞，其DNA MMR活力已有少部分受損。另外，Lei等［4］的研究結(jié)果顯示，人宮頸癌細(xì)胞Hela和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的相對(duì)熒光表達(dá)率分別為0.954和0.173，表明HCT116細(xì)胞的DNA MMR活力受損嚴(yán)重。我們研究過人正常肝細(xì)胞QSG-7701的DNA MMR活力，其相對(duì)熒光表達(dá)率為0.986，說明人正常細(xì)胞的DNA MMR活力比腫瘤細(xì)胞要強(qiáng)，這也從側(cè)面驗(yàn)證了DNA MMR活力與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系。

為進(jìn)一步明確CdCl2對(duì)細(xì)胞DNA MMR活性的干擾效應(yīng)，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了不同濃度CdCl2暴露后DNA MMR活性相關(guān)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1 mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果表明，5、10、15 μmol/L CdCl2暴毒ZR75-1細(xì)胞48 h后，上述4種基因的相對(duì)表達(dá)量為先上升后略微下降，整體為上升趨勢(shì)。其原因可能是CdCl2直接抑制了細(xì)胞DNA MMR活力［2］，但細(xì)胞仍需要維持其基因組的穩(wěn)定性，因而通過細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控體系增加MMR相關(guān)基因的表達(dá)來補(bǔ)償。

有文獻(xiàn)報(bào)道Cd2+可以與Zn2+競(jìng)爭(zhēng)某些酶活性部位而抑制酶活性［11］。在人體DNA錯(cuò)配修復(fù)過程中，hMSH2和hMSH6蛋白會(huì)形成酶復(fù)合物hMutSα，hMSH2 和hMSH3蛋白形成酶復(fù)合物hMutSβ［7］，這兩種酶復(fù)合物活性的激活依賴Zn2+的結(jié)合，Cd2+可通過與Zn2+競(jìng)爭(zhēng)酶復(fù)合物hMutSα、hMutSβ的活性部位，抑制hMSH2-hMSH6復(fù)合物的酶活性，從而抑制DNA MMR活性［11］。究竟CdCl2通過哪些途徑和方式抑制細(xì)胞DNA MMR活性，其具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：胡苗苗）

The inhibitory effect of CdCl2on DNA mismatch repair activity in ZR75-1 cells

LIU Xiaojuan1， CHEN Yuanhong1， LIU Ya2， HU Qidi2， REN Xiangpeng2.
1.School of Public Health and Environment， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035； 2.Laboratory Center， Ophthalmology and Eye Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Objective: To study the effects of CdCl2on the DNA mismatch repair （DNA MMR） activity in human breast cancer cells ZR75-1. Methods: MTT assay was used to detect the survival rate of ZR75-1 cells exposed 48 and 72 h to 0， 10， 20， 30， 40， 50 μmol/L CdCl2. The cells from 5， 10， 15 μmol/L CdCl2exposure （48 h） and control group were parallelly transfected with homoduplex and heteroduplex plasmids， flow cytometry analysis was then carried out to quantitatively measure the relative EGFP expression （indirectly reflected DNA MMR activity） in ZR75-1 cells of each groups. Meanwhile， real-time fluorescent quantitative PCR technique was used to detect the mRNA expression of DNA MMR related genes （MLH1， MSH2， MSH6 and PMS1） after exposure 48 h to 5， 10， 15 μmol/L CdCl2. Results: 10， 20 μmol/L CdCl2exhibited no influence on ZR75-1 cell survival （P＞0.05）， while cells exposed to 30， 40 and 50 μmol/L CdCl2displayed significant mortality which showed obvious dose-dependent and time-dependent manner （P＜0.05）. Compared with control group， 5， 10 and 15 μmol/L CdCl2exposure induced significant inhibition of DNA MMR activity in ZR75-1 cells （P＜0.05）. Real-time PCR results showed that after exposure to 5， 10 and 15 μmol/L CdCl2for 48 h， the mRNA expression of detected genes （MLH1， MSH2， MSH6 and PMS1） was increased as a whole， which presented down after rising first with CdCl2exposure concentration increase. Conclusion: Low dose of CdCl2exposure which showed no effect on cell survival can represse DNA MMR activity in ZR75-1 cells， and up-regulate the mRNA expression of DNA MMR related genes.

CdCl2； ZR75-1 cells； DNA mismatch repair

R994.6

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.003

2015-04-22

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（新苗人才計(jì)劃）項(xiàng)目（2011R413049）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（H201100 18）。

劉曉娟（1987-），女，湖南婁底人，實(shí)驗(yàn)員，碩士。

任湘鵬，副研究員，Email：renxpeng@wmu.edu.cn。