涂小珂，林燕奎，金曉蕾，林　黎，羅　潔，陳沛金

（深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術(shù)中心，深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518045）

空氣隔斷-連續(xù)流動分析法快速測定葡萄酒中總糖

涂小珂，林燕奎，金曉蕾，林黎，羅潔，陳沛金*

（深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術(shù)中心，深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518045）

目的：建立空氣隔斷-連續(xù)流動分析儀快速測定葡萄酒中總糖含量的分析方法。方法：用樣品校正葡萄糖標準溶液，同時在流路中增設透析器以減少樣品溶液帶來的基質(zhì)效應及顏色干擾。經(jīng)過條件優(yōu)化，流路溫度控制在88～92 ℃，水解反應時間、絡合反應時間分別為5 min和12 min。結(jié)果：在0.05～3.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，體系吸光度與溶液質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好（r2為0.999 7），方法檢出限為0.01 g/L，加標回收率在88.1%～102.3%之間，方法相對標準偏差為2.8%～6.2%；測定結(jié)果與GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》相比，相對標準偏差小于5%，測定快速（45 樣/h）。結(jié)論：方法適用于大批量葡萄酒中總糖含量的檢測。

葡萄酒；總糖；空氣隔斷-連續(xù)流動分析

近年來人們生活水平不斷提高，對葡萄酒的需求也不斷增長，葡萄酒的進口量呈每年遞增趨勢，已成為我國國際貿(mào)易中交易額最大的酒種。總糖是葡萄酒的一個重要理化指標，是區(qū)分葡萄酒種類的指標，其含量是判斷葡萄酒是否屬干紅的重要依據(jù)［1］，在進出口貿(mào)易中起到非常關(guān)鍵的作用。葡萄酒中總糖含量的檢測方法主要有直接滴定法［2］、間接碘量法［3］、電位滴定法［4］、3，5-二硝基水楊酸比色法［5］和硫酸苯酚-顯色法［6］等。實驗室的常規(guī)檢測方法為直接滴定法［2］，該方法對樣品中總糖含量、加熱溫度、滴定速度等都有一定要求，且存在實驗人員操作差異。3，5-二硝基水楊酸比色法和苯酚-硫酸顯色法都屬分光光度法，苯酚-硫酸法適用含糖量較高的樣品［7］；3，5-二硝基水楊酸法每批僅能測定少量樣品且結(jié)果受反應時間影響較大［7］。隨著葡萄酒貿(mào)易的增大，消費者對葡萄酒品質(zhì)要求越來越高，同時為了有效監(jiān)督進口葡萄酒質(zhì)量，有必要建立葡萄酒中總糖的快速、準確測定方法。

空氣隔斷-連續(xù)流動分析技術(shù)是一種現(xiàn)代濕化學分析法，通過蠕動泵將樣品和試劑定量地吸入特定分析模塊中進行混合反應，液體間以空氣泡間隔，并經(jīng)消解、蒸餾、透析、加熱等在線前處理步驟，最終形成有色化合物，經(jīng)檢測器比色，由電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)自動計算得出結(jié)果［8-10］?？諝飧魯?連續(xù)流動分析技術(shù)已廣泛應用于煙草、環(huán)保等領(lǐng)域［11-12］，在水質(zhì)檢測領(lǐng)域已發(fā)布了一系列分析方法的標準［13-16］。目前已有報道應用空氣隔斷-連續(xù)流動分析技術(shù)檢測葡萄酒中重金屬砷［17］、鉛［18］、鐵［19］、二氧化硫［19］和白黎蘆醇［20］等。應用空氣隔斷-連續(xù)流動分析技術(shù)檢測葡萄酒中總糖還未見報道。本實驗利用連續(xù)流動分析儀，建立葡萄酒中總糖快速測定方法。樣品在線水解、在線透析后在堿性條件下，通過反標法測定樣品的總糖含量。該方法操作簡單、分析快速、準確、靈敏度高，適用于大批量樣品快速的分析。本研究為食品中常規(guī)化學檢測的自動化研究提供新的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄糖（CAS：50-99-7，純度98%） 美國Sigma公司；鹽酸、無水碳酸鈉（均為分析純） 天津科密歐化學試劑公司；鹽酸新亞銅（色譜純） 日本東京化成工業(yè)株式會社；潤滑劑：聚氧乙烯四十二烷醚（Brij-35） 意大利SYSTEA S.p.A公司；實驗用水為超純水。所有試劑使用時都必須加入0.5～1 mL潤滑劑。

1.2儀器與設備

FUTURAⅡ連續(xù)流動分析儀（儀器由總糖反應模塊、比色池、多通道蠕動泵、XYZ自動進樣器、自動稀釋器及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成） 法國Alliance公司。

1.3方法

1.3.1標準曲線的制備

稱取105 ℃烘干3 h的葡萄糖5.000 0g，用純水溶解后，配制成50 g/L的儲備液，移取0.5、2.0、5.0、10、20、30 mL儲備液，用純水配制成0.05、0.20、0.50、1.0、2.0、3.0 g/L的標準系列。

參照GB 15037—2006《葡萄酒》［21］方法對葡萄酒樣品定值，將定值后的樣品稀釋成0.05～3.0 g/L標準系列，以此標準系列測定上述葡萄糖標準溶液的質(zhì)量濃度，其測定結(jié)果作為上機使用的校準葡萄糖標準系列。

1.3.2樣品處理

取25 mL樣品于100 mL比色管中，加水稀釋后，取5 mL樣品上機測定。稀釋倍數(shù)根據(jù)樣品中總糖的含量而定，使稀釋后的總糖含量在0.05～3.0 g/L范圍內(nèi)。

1.3.3連續(xù)流動分析法的建立

1.3.3.1測定原理

在堿性條件下，總糖水解生成的還原糖與鹽酸新亞銅反應生成黃色偶氮物質(zhì)，通過測定其吸光度大小計算出總糖的含量。本研究根據(jù)這一測定原理設計了分析流路。利用流動注射分析儀的在線水解系統(tǒng)使葡萄酒中的總糖水解為還原糖，在Na2CO3緩沖溶液的作用下，還原糖與鹽酸新亞銅直接反應生成黃色偶氮物質(zhì)，其在波長450 nm處有最大吸收，選擇波長450 nm為檢測波長測定產(chǎn)物的生成，與標準系列進行比較從而得出樣品中總糖的含量。標準系列采用已知總糖質(zhì)量濃度的樣品反標，減少葡萄酒酒體顏色較深所帶來的系統(tǒng)誤差，再采用透析器去除流路中的大分子成色物質(zhì)，進一步消除色素等對顯色反應的干擾。

1.3.3.2測定流路的建立

圖1　連續(xù)流動分析儀測定葡萄酒中總糖的流路圖Fig.1　Flow scheme for the determination of total sugar

檢測流路如圖1所示。樣品、鹽酸溶液和空氣通過蠕動泵分別、連續(xù)地進入反應管道，在混合圈充分混合后，通過加熱器總糖水解為還原糖，同時蠕動泵在流路中引入Na2CO3溶液，在泵壓和載氣推動下，Na2CO3溶液與水解溶液進入透析系統(tǒng)，凈化后，經(jīng)三通管排除廢液；剩余溶液與鹽酸新亞銅溶液通過混合、加熱、顯色進入比色池，通過比較吸光度大小計算樣品中總糖含量。

1.3.3.3儀器分析條件

樣品分析速度：45 個/h；進樣時間：30 s；清洗時間：50 s；尋峰時段：95～105 s；測定波長450 nm，參比波長620 nm；水解加熱池溫度：88 ℃；分析加熱池溫度：92 ℃；以工作曲線最高質(zhì)量濃度點（3.0 g/L）為識別峰，峰值大于0.6（以吸光度表示）即可分析。

2　結(jié)果與分析

2.1標準工作溶液的校準

在所有葡萄酒的總糖測定方法中，都以葡萄糖作為標準溶液進行測定。但在測定過程中發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖做標準溶液時，儀器測定結(jié)果與國標測定結(jié)果差異較大。這是由于方法依據(jù)絡合產(chǎn)物在特定波長條件下的吸光度來定量，因此反應體系的顏色較深時會對吸光度有一定的干擾。大部分葡萄酒都含有很高的呈色物質(zhì)，樣品的基質(zhì)效應對絡合物的吸光度有一定影響。為了消除樣品的基質(zhì)效應，本實驗采用已知總糖質(zhì)量濃度的樣品來標定葡萄糖標準溶液的質(zhì)量濃度，以反標后的葡萄糖溶液作為測定用標準工作溶液。由表1可以看出，采用配制的葡萄糖標準溶液測定結(jié)果與國家標準方法相對標準偏差為0%～8.79%，采用標定后標準溶液測定結(jié)果相對標準偏差為－0.97%～4.12%，結(jié)果表明采用反標法可以消除樣品基質(zhì)效應，使測定結(jié)果更準確。

表1　連續(xù)流動分析法、樣品反標法與國標滴定法比對實驗（n=3）Table1　Comparison of continuous flow analysis with two other methods （n=3）

2.2連續(xù)流動分析儀流路的選擇和優(yōu)化

2.2.1加熱池溫度的選擇和優(yōu)化

加熱池的溫度對總糖水解反應和還原糖絡合反應有較大的影響。加熱池溫度較低時，總糖水解不完全，加熱溫度過高時，會引起碳水化合物水解及糖的焦化反應。還原糖與鹽酸新亞銅的絡合反應需要在高溫條件下進行，溫度越高反應越完全。2 個反應對溫度的要求有一定差異，對于一個封閉的流路來說，太大的溫差容易形成壓力差，使溶液倒灌。本實驗采用3.0 g/L蔗糖溶液，從70 ℃開始逐漸升高水解溫度，以單糖的生成率優(yōu)化水解溫度；以3.0 g/L葡萄糖溶液與鹽酸新亞銅絡合反應絡合物的生成率優(yōu)化絡合反應溫度。結(jié)果表明：溫度低于85 ℃時，蔗糖水解不完全，絡合溫度低于92 ℃，絡合反應不完全。加熱池溫度在88～92 ℃之間，水解反應和絡合反應都能完全進行且整個流路不會產(chǎn)生較大壓力差。因此本實驗選擇水解溫度為88 ℃，絡合反應溫度為92 ℃。

2.2.2加熱池中混合圈的選擇和優(yōu)化

加熱池中混合圈的大小控制整個流路的化學反應時間及反應體系的pH值?；旌先讖皆酱?，反應時間越長。本實驗以3.0 g/L蔗糖溶液，考察了水解溫度在88 ℃時不同反應時間對總糖水解的影響。以3.0 g/L的葡萄糖糖溶液，在92 ℃條件下考察不同反應時間與鹽酸新亞銅的絡合效果。實驗結(jié)果表明：反應時間小于5 min，蔗糖水解不完全；反應時間大于5 min，蔗糖水解完全。在92 ℃條件下，12 min以后，絡合產(chǎn)物可達90%以上，考慮到在高溫條件下水解時間過長容易產(chǎn)生糖醛反應，因此加熱池選擇混合圈孔徑為2 mm，使其水解時間控制在5 min，絡合反應時間控制在12 min。

2.2.3透析器對測定的影響

利用樣品校正標準溶液較好的解決了樣品反應體系與標準溶液反應體系因顏色不一致所帶來的誤差，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)部分樣品的儀器測定結(jié)果與標準方法測定結(jié)果仍存在較大差異。通過研究發(fā)現(xiàn)，水解液經(jīng)堿中和以后，溶液的顏色較水解反應前變深，紅葡萄酒的顏色可以從酒紅色變?yōu)楹谏?，樣品溶液的顏色變化是導致誤差的主要原因。為減少誤差，在水解反應后的流路上增加一個透析器，通過透析膜的選擇性吸收原理，將溶液中大分子的色素和其他雜質(zhì)過濾出來，與廢液一起排出。采用這種方式，不僅可以減少樣品顏色變化所帶來的測定誤差，同時由于去除了溶液中的大分子物質(zhì)，避免其在檢測池中的沉淀，可以延長檢測池的使用壽命。

2.3方法線性范圍、定量限、精密度和回收率

在上述實驗條件下，將標準工作溶液逐級稀釋進樣，測定吸光度及基線噪音強度，考察連續(xù)流動分析儀測定葡萄酒總糖時樣品質(zhì)量濃度與信號的線性關(guān)系。結(jié)果表明，溶液中總糖含量在0.05～3.0 g/L范圍內(nèi)，Y=3.723X－0.008，r2為0.999 7，呈良好的線性關(guān)系；檢出限為0.01 g/L，以3 倍信噪比計算。對實際樣品進行3 個水平加標實驗，每個水平重復測定6 次，測定平均回收率及精密度（以相對標準偏差表示）。實驗表明，方法回收率為88.1%～102.3%，相對標準偏差為2.8%～6.2%。具體結(jié)果見表2。

表2　連續(xù)流動分析法測定樣品中總糖的回收率、精密度（n=6）Table2　Recoveries and relative standard deviations （RSDs） of total sugar in samples （n = 6）

2.4 樣品測定

抽取干型、半干、半甜、甜型4 種不同類型的葡萄酒樣品分別用國標方法的直接滴定法、連續(xù)流動分析法及樣品反標-連續(xù)流動分析法進行測定。結(jié)果對比見表1。從比對數(shù)據(jù)看出，連續(xù)流動分析法測定結(jié)果與國標方法差異較大，隨著糖度的增加，差異增大，相對標準偏差最大達12%，而樣品反標-連續(xù)流動分析法的方法差異明顯減小，該方法具有良好的精密度，且儀器檢測速度快，達45 樣/h。

3　結(jié) 論

本實驗利用空氣隔斷-連續(xù)流動分析技術(shù)建立了一種測定葡萄酒中總糖含量的新方法。結(jié)果表明，該方法簡單、快速、靈敏度高，與國標方法測定結(jié)果的相對標準偏差小于5%，滿足理化分析方法的質(zhì)量控制要求［22］，本方法適用于各類型葡萄酒中總糖含量的高通量快速測定。

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Determination of Total Sugar in Wine by Air-Segmented Continuous Flow Analysis

TU Xiaoke， LIN Yankui， JIN Xiaolei， LIN Li， LUO Jie， CHEN Peijin*
（Shenzhen Key Laboratory of Detection Technology R & D on Food Safety， Food Inspection Center of CIQ-Shenzhen，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shenzhen 518045， China）

Objective： To develop a method for the determination of total sugar in wine by air-segmented continuous flow analysis （CFA）. Methods： Glucose standard solution corrected with sample and the addition of dialyser in the flow path were used to reduce the matrix effects and color interference. Stream temperature was controlled at 88-92 ℃， and hydrolytic reaction and complexation reaction were carried out for 5 and 12 min， respectively. Results： In the concentration range of 0.05-3.0 g/L， there was a good linear relationship between absorbance and concentration （r2= 0.999 7）. The limit of quantification （LOD） was 0.01 g/L. The recoveries were in the range of 88.1%-102.3% with relative standard deviations（RSD） between 2.8% and 6.2%. Compared with the titration method from the national standard of China （GB/T 15038—2006）， the relative error was less than 5% and the sample frequency was 45/h. Conclusion： The presented method can be used to determine total sugar in large quantities of wine.

wine； total sugar； air-segmented continuous flow analysis （CFA）

TS207.3

A

1002-6630（2015）14-0087-04

10.7506/spkx1002-6630-201514017

2014-11-25

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK124）

涂小珂（1978—），女，工程師，碩士，研究方向為食品理化檢測。E-mail：tuxiaoke@163.com

陳沛金（1979—），女，工程師，學士，研究方向為食品和化妝品理化檢測。E-mail：szciqfood@126.com