張 輝 俞誠(chéng)波 張蓓蓓 葉美華 蔡敏秋 許紅苗 林敏麗

溫州醫(yī)學(xué)院附屬溫嶺醫(yī)院口腔科，浙江溫州 317500

白色念珠菌（Canidia albicans）是一種常見的條件 致病菌[1-2]，正常情況下白色念珠菌不引起疾病，與機(jī)體共生，機(jī)體發(fā)生白色念珠菌感染的主要原因是正常的防御功能受到損害。白色念珠菌普遍存在于人體中，調(diào)查顯示[3]，口腔中白色念珠菌帶菌率最高，約為85%。近年來大量廣譜抗生素以及免疫抑制劑的使用導(dǎo)致菌群失調(diào)和機(jī)體免疫力降低，使得非致病性白色念珠菌轉(zhuǎn)化為條件致病菌而引起各組織感染。研究顯示[4]，口腔白色念珠菌感染屬于慢性感染，難以徹底根治，且病情容易反復(fù)發(fā)作，給患者的日常生活造成嚴(yán)重影響。關(guān)于白色念珠菌的致病機(jī)制目前仍無明確結(jié)論，有報(bào)道稱[5]，黏附作用在白色念珠菌定植、侵襲中發(fā)揮著重要作用?？谇火つど掀そ琴|(zhì)細(xì)胞是口腔防御的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是白色念珠菌侵襲的主要靶細(xì)胞，但是白色念珠菌是如何侵襲口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞并產(chǎn)生致病作用，目前仍未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過分析白色念珠菌對(duì)口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞的黏附作用以及對(duì)增殖和凋亡的影響，以期為豐富臨床治療提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究成果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC90029）購(gòu)自南京便診生物科技有限公司，人口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院；沙堡（4%）葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）購(gòu)自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；其他相關(guān)儀器和試劑均由溫州醫(yī)學(xué)院附屬溫嶺醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌培養(yǎng) 將ATCC90029白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)于沙堡培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)種3次后配成菌懸液，濃度設(shè)定為3×105CFU/mL。孢子型白色念珠菌：將白色念珠菌接種于酵母膏胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出白色乳狀菌落，將菌落再轉(zhuǎn)種于含YPD培養(yǎng)基的離心管中，37℃孵育18 h。菌絲型白色念珠菌：將白色念珠菌接種于pH 6.0、含10%磷酸鹽緩沖液（PBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃孵育3～5 h即誘導(dǎo)出菌絲型白色念珠菌。

1.2.2 口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的角質(zhì)細(xì)胞，用含0.02%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的胰蛋白酶（0.25%）消化，將細(xì)胞收集并離心，棄去上清液，加入預(yù)先配置的凍存液，將細(xì)胞吹打混勻。-80℃保存待用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48 h，將細(xì)胞貼壁制成單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液后用PBS沖洗3次。將加入菌絲型白色念珠菌的作為菌絲組，加入孢子型白色念珠菌的作為孢子組，單獨(dú)培養(yǎng)的口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。

1.2.4 黏附試驗(yàn) 生長(zhǎng)期口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化，將孢子型、菌絲型白色念珠菌分別與口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，用濾膜收集口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞，再用PBS洗濾3次，收集懸液離心，并制成涂片；待風(fēng)干后進(jìn)行染色，電鏡下觀測(cè)黏附現(xiàn)象。隨機(jī)選擇100個(gè)口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)白色念珠菌總數(shù)，并計(jì)算黏附指數(shù)。黏附指數(shù)=黏附白色念珠菌數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)量3次，取3次均值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 生長(zhǎng)期口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞用胰蛋白酶消化，將不同表型白色念珠菌加入培養(yǎng)瓶中感染，并于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后胰蛋白酶消化，再用PBS沖洗3次，離心棄上清液。加入10 μL異硫氰酸熒光素混勻，室溫避光反應(yīng)20 min；再加入5 μL碘化丙啶后，采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，并用軟件分析G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。上述操作平行重復(fù)3次，取均值。增殖指數(shù)（PI）=[（S+G2/M）/G0/G1+S+G2/M]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組黏附指數(shù)與凋亡率比較

菌絲組黏附指數(shù)顯著高于孢子組 （P＜0.05）；菌絲組凋亡率顯著高于孢子組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），而孢子組和陰性對(duì)照組凋亡率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 見表 1。

表1 各組黏附指數(shù)與凋亡率比較（±s）

表1 各組黏附指數(shù)與凋亡率比較（±s）

注：與孢子組比較，aP＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP＜0.05；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 黏附指數(shù) 凋亡率（%）菌絲組孢子組陰性對(duì)照組7.63±1.39a 3.47±1.04-3.49±0.47ab 2.07±0.15 1.98±0.07

2.2 各組口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞周期比較

菌絲組G0/G1期細(xì)胞比例顯著低于孢子組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），S期、G2/M期細(xì)胞比例上升，且顯著高于孢子組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），PI明顯高于孢子組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），孢子組和陰性對(duì)照組PI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞周期及增殖指數(shù)比較（%，±s）

表2 各組口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞周期及增殖指數(shù)比較（%，±s）

注：與孢子組比較，aP＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP＜0.05

組別增殖指數(shù)細(xì)胞周期G0/G1期 S期 G2/M期菌絲組孢子組陰性對(duì)照組38.17±7.83ab 49.47±11.41 57.71±9.39 8.54±4.03ab 6.47±2.73 5.35±2.11 20.18±9.59ab 10.71±3.19 12.38±4.35 42.79±18.73ab 28.67±8.79 26.87±7.64

3 討論

口腔念珠菌感染是真菌-念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病[6]，又稱口腔念珠菌病。近年來，由于抗生素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，發(fā)生菌群失調(diào)或免疫力降低，使內(nèi)臟、皮膚、黏膜被真菌感染者日益增多，口腔黏膜念珠菌病的發(fā)生率也相應(yīng)增高[7-8]，其中，白色念珠菌是最主要的病原菌。鵝口瘡（雪口病）是最常見的口腔念珠菌病。25%～50%的健康人口腔、陰道、消化道可帶有念珠菌，但不發(fā)?。欢侵虏⌒阅钪榫?，在某種條件下，可轉(zhuǎn)化為致病性[9]，故有人稱念珠狀菌為條件致病菌。在幼兒雪口病、托牙性口炎、口角炎、念珠菌性白斑病和慢性黏膜皮膚念珠菌病患者中，白色念珠菌的檢出率分別為84%、69%、77%、84%和100%[10]。念珠菌毒性的強(qiáng)弱，取決于毒性物質(zhì)的代謝產(chǎn)物。在消化道或陰道內(nèi)寄生的酵母型念珠菌并無致病性，而當(dāng)它發(fā)育為菌絲型時(shí)，才有致病性。白色念珠菌的毒素具有相當(dāng)于病毒的磷脂酶-A型的活性[11]，以本菌的混懸液注入動(dòng)物靜脈中可致死。因此，病原菌的毒性和類型，與疾病力有密切關(guān)系。在健康帶菌者中，唾液含菌量低于200 CFU/mL，因此，一般鏡檢法不能直接查見涂片中的病原體。白色念珠菌對(duì)口腔黏膜上皮有較強(qiáng)的黏附性，這是它致病作用的“立足點(diǎn)”，此種黏附性依靠上皮細(xì)胞表面的甘露糖苷蛋白部分[12]，作為細(xì)胞的表面受體而發(fā)揮其黏附作用。因此，可破壞糖苷蛋白或相似結(jié)構(gòu)物抑制黏附的發(fā)生，這對(duì)探索新的治療藥物提供了方向。

角質(zhì)細(xì)胞是上皮細(xì)胞的重要組成部分，它為機(jī)體抵御外界病原菌侵襲提供了一層機(jī)械性屏障。目前研究證實(shí)[13]，角質(zhì)細(xì)胞是口腔黏膜損傷的靶細(xì)胞。Obokata等[14]研究中也提到，角質(zhì)細(xì)胞是口腔黏膜上皮中含量最多的一種細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生白色念珠菌感染時(shí)，其也是主要侵襲靶細(xì)胞。白色念珠菌廣泛存在于人和動(dòng)物中，正常條件下不會(huì)致病；但有多數(shù)研究顯示，白色念珠菌具有潛在致病性。Martinez等[15]證實(shí)，白色念珠菌感染疾病中，病變區(qū)上皮細(xì)胞明顯增厚，深層顯著增生，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂加速，常伴有錯(cuò)角化，因此推測(cè)白色念珠菌可以導(dǎo)致口腔黏膜出現(xiàn)白斑損害。但是白色念珠菌的具體作用機(jī)制目前還不清楚，有研究認(rèn)為[16]，白色念珠菌致病性主要體現(xiàn)在侵襲能力，目前已知與侵襲能力相關(guān)的因素包括黏附性、疏水性和表型轉(zhuǎn)換等。黏附性是白色念珠菌侵襲的第一步，也是其強(qiáng)致病力的主要標(biāo)志。江文俊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌主要存在芽生孢子和假菌絲兩種形式，也即孢子型和菌絲型，但是究竟何種類型的菌株具有致病性尚無統(tǒng)一定論。在本研究中，菌絲組黏附指數(shù)顯著高于孢子組，這與陽(yáng)雋等[18]報(bào)道結(jié)論相同，說明菌絲型的黏附能力大于孢子型。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[19]，白色念珠菌菌絲形成進(jìn)一步促進(jìn)黏附作用，而黏附也會(huì)加速菌絲形成。因此，可以初步推測(cè)，白色念珠菌菌絲的形成有利于提高黏附性。

細(xì)胞凋亡是清除細(xì)胞的正常途徑，若正常凋亡受到影響，將會(huì)促進(jìn)細(xì)胞異常發(fā)育和腫瘤的產(chǎn)生。李燕等[20]研究顯示，隨著腫瘤生長(zhǎng)的加速，細(xì)胞凋亡數(shù)量也隨之增加。曹婕等[21]對(duì)口腔黏膜上皮脫落碎片進(jìn)行檢測(cè)后證實(shí)，口腔惡性腫瘤或癌前病變的唾液中存在明顯細(xì)胞凋亡情況，其凋亡與口腔白斑密切相關(guān)。高巖等[22]也發(fā)現(xiàn)，白斑癌變中，細(xì)胞凋亡參與了整個(gè)過程，且在不同過程作用各異，隨著上皮細(xì)胞增生的加重，凋亡呈指數(shù)上升。本次研究中菌絲組凋亡率顯著高于孢子組和陰性對(duì)照組，證實(shí)菌絲的產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能是白斑發(fā)生癌變的原因之一。

在細(xì)胞周期中，G1期是RNA和DNA聚合酶合成期，S期是DNA合成期。一般情況下，繁殖旺盛的細(xì)胞在S期、G2/M期比例較高。而PI則代表整個(gè)群體中細(xì)胞增殖的能力。為了進(jìn)一步研究此過程，本研究對(duì)細(xì)胞不同分裂時(shí)期的細(xì)胞比例進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，菌絲組G0/G1期細(xì)胞比例顯著低于孢子組和陰性對(duì)照組，S期、G2/M期細(xì)胞比例顯著高于孢子組和陰性對(duì)照組，PI也隨之增加。說明菌絲型能夠促進(jìn)口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞的增長(zhǎng)，其機(jī)制可能是促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致DNA合成加快，細(xì)胞增殖速度增加。此外本結(jié)果也提示白色念珠菌對(duì)口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用依賴于菌株的毒性作用和細(xì)胞的感染能力。目前多數(shù)專家達(dá)成的共識(shí)是：白色念珠菌中的毒性作用導(dǎo)致口腔黏膜上皮角質(zhì)細(xì)胞中抑制增殖物質(zhì)合成減少，使上皮細(xì)胞過度角質(zhì)化，細(xì)胞出現(xiàn)異常增生，并可能發(fā)生癌變。本研究結(jié)論與上述觀點(diǎn)完全相符。當(dāng)然白色念珠菌導(dǎo)致口腔癌變的機(jī)制較多，而本研究也只是初步探討了其癌變可能的機(jī)制之一，但是本實(shí)驗(yàn)證實(shí)白色念珠菌的表型與口腔白斑和癌變密切相關(guān)，這需要引起臨床重視。

綜上所述，白色念珠菌能夠?qū)е驴谇火つど掀そ琴|(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡和增殖周期改變，這種改變依賴于該菌的黏附性和感染性。

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