馬宇瀟，李 偉，陳曉紅，姜 梅，芮 昕，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

甘南牧區(qū)犏牛酸奶中優(yōu)良乳酸菌的分離與鑒定

馬宇瀟，李 偉，陳曉紅，姜 梅，芮 昕，董明盛*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

從甘南牧區(qū)采集的犏牛酸奶中分離得到76 株乳酸菌。篩選得到3 株凝乳快速、產(chǎn)酸力強(qiáng)、凝乳質(zhì)地優(yōu)良的乳酸菌菌株，包括1 株球菌和2 株桿菌。采用16S rRNA基 因序列比對分析，鑒定3 株乳酸菌分別是屎腸球菌（Enterococcus faecium）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。通過球桿菌混合發(fā)酵實驗，結(jié)果表明混合菌株發(fā)酵的產(chǎn)酸速率比單菌株發(fā)酵明顯加快，且后酸化程度較弱，其感官質(zhì)量也明顯優(yōu)于單菌發(fā)酵。

犏牛酸奶；乳酸菌；分離；發(fā)酵性能

酸奶發(fā)酵劑是指為制作酸奶而調(diào)制的特定微生物的培養(yǎng)物［1］。發(fā)酵劑的優(yōu)劣直接決定了生產(chǎn)出酸奶質(zhì)量的好壞。酸奶發(fā)酵劑一般由兩種乳酸菌組成：嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌［2］。但是，生產(chǎn)用發(fā)酵劑也存在一定的缺陷：經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌并不能抵抗胃酸、膽汁的腐蝕，進(jìn)入小腸前幾乎消失殆盡。因此，多角度篩選性能優(yōu)良的乳酸菌的研究仍具有很大空間［3］。我國地域遼闊，各個少數(shù)民族都有自己特色的發(fā)酵食品，尤其是邊疆少數(shù)民族自然發(fā)酵的產(chǎn)品中常存在性能優(yōu)良的乳酸菌，研究高原獨特乳制品的微生物組成顯得尤為重要。

犏牛是牦牛和黃牛相互雜交的種間雜種［4］，能夠適應(yīng)高海拔和寒冷氣候，可以全年放牧［5］，是青藏高原獨特的優(yōu)勢畜種之一。據(jù)報道犏牛奶中的蛋白質(zhì)含量豐富，品質(zhì)優(yōu)良，其氨基酸含量均高于其他牛奶［6］。采用犏牛奶制作的犏牛酸奶具有組織細(xì)膩，結(jié)構(gòu)致密，風(fēng)味獨特的特點，是我國甘肅甘南藏族自治州牧民常食用的酸奶品種。迄今為止犏牛酸奶仍然采用傳統(tǒng)的天然發(fā)酵方式制作，對其中微生物組成還沒有系統(tǒng)研究，基于此，本研究從甘南藏族自治州合作市郊區(qū)的牧民家中采集犏牛酸奶樣品，并從中分離乳酸菌菌株，對其發(fā)酵性能進(jìn)行研究，以獲得性質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌菌株，期望為工業(yè)發(fā)酵劑的生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品來源

犏牛酸奶是采自甘肅甘南牧區(qū)3 個牧民家庭自制的犏牛乳酸奶，擠乳時間前后不超過1 d。牧民通常方法是將擠出的新鮮犏牛奶加熱至煮沸，冷卻到不燙手，加入上次剩余的成熟酸奶作為發(fā)酵引子（發(fā)酵劑），再用棉被或者衣服包裹，放置于燒熱的土炕上，溫度大約為35～40 ℃，待發(fā)酵至凝乳即可食用，基本無需后熟的過程。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基［7］；Lee培養(yǎng)基；改良M17瓊脂培養(yǎng)基［8］；酵母粉葡萄糖氯霉素瓊脂（YGC）：上海恒斐生物科技有限公司；酸化MRS培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基組成不變，其中檸檬酸二銨改為檸檬酸三銨，pH值適當(dāng)調(diào)整為pH 5.4～5.2，115 ℃滅菌20 min［9］。

1.1.3試劑

“川秀”乳酸菌酸奶發(fā)酵劑（含嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌，S. t & L. b）作對比實驗；革蘭氏染液、0.85 g/mL生理鹽水、0.1 mol/L NaOH 實驗室自行制備。

1.2儀器與設(shè)備

電子顯微鏡 新飛達(dá)光學(xué)儀器公司；OJ300型電子天平 常熟衡器工業(yè)公司；立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工作臺蘇州超凈集團(tuán)安泰公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海益恒實驗儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品采集

先將樣品攪拌至均勻，使上浮的乳脂均勻分布于酸奶中，再用無菌滅菌器吸取20 mL樣品［10］，置于無菌采樣袋中，每種樣品取3 份，做好標(biāo)記，于冰盒中帶回實驗室及時處理。

1.3.2分離純化和形態(tài)觀察

犏牛酸奶樣品在MRS和Lee平板上進(jìn)行涂布和劃線分離，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取菌落大小、顏色等不同的單菌落繼續(xù)劃線，直至分離出純種［11］。進(jìn)行革蘭氏染色，并鏡檢其形態(tài)，觀察是否為革蘭氏陽性菌［12］。將體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液滴于鏡檢為革蘭氏陽性的菌落，若無氣泡，初步鑒定為過氧化氫酶陰性。純化的菌種與體積分?jǐn)?shù)40%的甘油等體積混勻，低溫（-20 ℃）保存［13］。

1.3.3篩選

根據(jù)滴定酸度、pH值、凝乳時間及感官評價為標(biāo)準(zhǔn)篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌，具體如下：

將活化2 代的菌液以體積分?jǐn)?shù)3%接種于鮮牛奶中，在凝乳和后熟24 h后測定酸度（以°T表示），用pH計測定pH值，評價其酸度是否達(dá)到酸奶要求。將凝乳后的酸奶冷藏24 h，由10 名食品專業(yè)人員包括：色澤、滋氣味、組織狀態(tài)等進(jìn)行打分。綜合感官評分結(jié)果用下式表示。

綜合感官評分=色澤分值+滋氣味 分值×4+組織狀態(tài)分值×5

式中，若乳清析出則組織狀態(tài)得分＜5分，異味得1分，每個項目總分10分［14］。

1.3.4最適溫度的確定

分離條件同樣在很大程度上也影響分離結(jié)果［15］，最適溫度也是確定它發(fā)酵溫度的標(biāo)準(zhǔn)。將活化后的菌種接種于滅菌牛奶中，分別于31、37、42 ℃培養(yǎng)至凝乳，觀察凝乳狀態(tài)，測定酸度和pH值來判斷其最佳生長溫度。

1.3.5單菌及復(fù)合菌株發(fā)酵特性的研究

利用復(fù)篩得到的長桿菌和短桿菌分別和球菌復(fù)配，評價其混合發(fā)酵性能，另將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑酸奶作比較（在其最適溫度42 ℃條件下測定發(fā)酵性能）。

產(chǎn)酸能力：對單菌和復(fù)合菌進(jìn)行發(fā)酵實驗，培養(yǎng)溫度為37 ℃，從培養(yǎng)0 h開始測定其酸度和pH值，每1 h一次，直至凝乳時停止測定。

后酸化能力：將凝乳后的酸奶放置冰箱進(jìn)行后熟，24 h之后測定其酸度和組織狀態(tài)。

感官評定：同復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.616S rDNA的擴(kuò)增和序列分析

細(xì)菌DNA的提取方法在文獻(xiàn)［16］的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)。提取菌株DNA，以細(xì)菌16S rDNA通用引物作為其上下游引物，染色體DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循環(huán)30 次；72 ℃ 10 min［17］。

擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，而PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對。

將乳酸菌測序后所得序列與GenBank獲得相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，用Clustal X進(jìn)行比對，采用Neighbor-Joining法在MEGA3.1中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析鑒定乳酸菌與模式菌株的同源性。

2　結(jié)果與分析

2.1甘南牧區(qū)酸奶中乳酸菌的分離與篩選

將3 種樣品原樣劃線在MRS，Lee瓊脂培養(yǎng)基上，從中挑取出76 株乳酸菌菌株，將革蘭氏染色呈陽性且觸酶實驗陰性的菌株初步鑒定為乳酸菌［18］。顯微鏡觀察表明，其中43 株為球菌，33 株為桿菌。

用76 株乳酸菌分離株進(jìn)行酸奶發(fā)酵實驗，從中篩選出3 株滴定酸度大于60 °T，pH值低于4.65，且凝乳感官特性良好的乳酸菌菌株，分別命名為PQ-4、PG-3和PG-13，結(jié)果見表1。

表1　菌株的形態(tài)與發(fā)酵特性Table1 Phenotypical characters of the isolated strains of LAB

由表1可知，球菌PQ-4產(chǎn)酸慢，發(fā)酵時間長，滴定酸度低，但凝乳細(xì)膩、奶香味濃；短桿菌PG-30發(fā)酵時間、酸度適中，有酸奶特有香味，質(zhì)地最黏稠細(xì)膩；長桿菌PG-13，發(fā)酵時間最短，產(chǎn)酸最快，凝乳略有顆粒，酸味較重。

2.2篩選菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增與分子生物學(xué)鑒定以菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到1 500 bp左右特異性擴(kuò)增片段，如圖1所示。

圖1　乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplified products of 16S rDNA from the three isolates

測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，初步確定屬，結(jié)果見表2。

表2　細(xì)菌16S rDNA序列分析結(jié)果Table2 Similarity of 16S rDNA sequences retrieved from bacteria

圖2　16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

構(gòu)建以分離菌株和其相關(guān)13 種模式株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）：菌株P(guān)G-13和德氏乳桿菌模式菌株（NWL74）處于一個分支，同源性為100%，此菌株為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii PG-13）；菌株P(guān)G-30與發(fā)酵乳桿菌模式株（KNO2）處于一個分支，同源性為100%，因此菌株P(guān)G-30為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum PG-30）；菌株P(guān)Q-4與屎腸球菌模式菌株044處于較近分支，16S rRNA基因序列同源性為99%，為屎腸球菌（Enterococcus faecium PQ-4）。

2.3菌株最適發(fā)酵溫度的確定

圖3　不同發(fā)酵溫度下凝乳的酸度Fig.3 Titratable acidity produced at different culture temperatures

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度不斷升高時，3 株菌凝乳時酸度也不斷升高；每株菌在不同溫度下產(chǎn)酸程度不同，組間組內(nèi)差異性顯著（P＜0.05）；3 株菌在31 ℃發(fā)酵比37、42 ℃發(fā)酵的凝乳時間長，組間差異性顯著（P＜0.05），37 ℃和42 ℃發(fā)酵凝乳時間相差不大，組間組內(nèi)差異不顯著（P＞0.05）。

來自不同地區(qū)的樣品，在微生物計數(shù)和pH值等方面都有所不同［19］，在對傳統(tǒng)食品中的乳酸菌進(jìn)行分離和純化時，應(yīng)當(dāng)把分離條件作為一個重要的實驗因素進(jìn)行設(shè)計［20］?？紤]到甘南牧區(qū)氣溫較低，牧民制 作犏牛酸奶時用燒熱的炕保溫較長時間，炕面的溫度大約在30～37 ℃左右，酸乳中的乳酸菌和其他菌類在這樣的溫度環(huán)境下，共生作用最佳，不合適的溫度會對破壞原有的共生作用；并且考慮到37 ℃和42 ℃能達(dá)到相同凝乳且酸度相差不大，選擇37 ℃作為分離菌株、培養(yǎng)菌種和發(fā)酵酸奶的最佳培養(yǎng)溫度。

2.4發(fā)酵性能研究

2.4.1單菌及混合菌產(chǎn)酸能力

圖4　單菌及復(fù)合菌發(fā)酵至凝乳的酸度變化Fig.4 Changes in acidity during fermentation course

由圖4、5可知，PQ-4菌的凝乳時間長于PG-13、PG-30，是因為乳酸桿菌較球菌而言，更能有效地利用賴氨酸、脯氨酸和纈氨酸產(chǎn)生乙酸、丙酸和月桂酸等物［21］；以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為主發(fā)酵劑的酸奶在7 h時凝乳，凝乳時酸度為67.3 °T，而PG-13、PG-30單菌發(fā)酵，凝乳時間在6～7 h內(nèi)，酸度均能達(dá)到68.0～82.3 °T，單菌發(fā)酵就能達(dá)到商用發(fā)酵劑的要求；菌種復(fù)配后依然凝乳且凝乳酸度有所降低，復(fù)合菌株發(fā)酵的牛乳在4 h之內(nèi)已達(dá)到凝乳狀態(tài)，速率高于單獨培養(yǎng)，也快于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共發(fā)酵的酸奶，符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。有報道［22］稱：嗜熱鏈球菌在乳中產(chǎn)生一些代謝物可促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長，不同形態(tài)的菌株之間，在其特征生化代謝上相互彌補(bǔ)相互支持［23］；桿菌和球菌 相互作用從而使得牛乳的發(fā)酵結(jié)果更好。

圖5　單菌及復(fù)合菌發(fā)酵至凝乳的pH值變化Fig.5 Changes in pH during fermentation course

圖6　不同菌株的后酸化能力Fig.6 Postacidification during yogurt refrigeration

2.4.2單菌及復(fù)合菌后酸化能力

由圖6可知，這3 株菌的后酸化能力差異較大：菌株P(guān)Q-4的后酸化能力最弱，菌株P(guān)G-30菌次之，菌株P(guān)G-13發(fā)酵酸奶在4 ℃冷藏后滴定酸度增加幅度很大，說明這株桿菌的后酸化能力比較強(qiáng)，也說明所篩選桿菌的后酸化能力比球菌的后酸化能力強(qiáng)。在4 ℃冷藏過程中，桿菌的產(chǎn)酸能力相對球菌較強(qiáng)，可能是因為桿菌的耐酸、耐低溫能力較球菌強(qiáng)［24］，而單獨用桿菌發(fā)酵的牛乳后酸化能力很強(qiáng)，菌種復(fù)配后，后熟期間酸度下降緩慢，延緩了酸奶過分后酸化的現(xiàn)象。

2.4.3感官評定結(jié)果

由表3可知，單菌發(fā)酵時，球菌發(fā)酵的酸奶組織狀態(tài)較好，香味濃郁，單獨桿菌發(fā)酵的酸奶后熟后酸味較重，可以通過調(diào)節(jié)氧化還原電位來修改球菌在酸奶生產(chǎn)代謝途徑，從而控制香氣的形成［25］。表中球菌占優(yōu)勢發(fā)酵的酸奶的綜合風(fēng)味，優(yōu)于球桿菌等比例和保加利亞乳桿菌占優(yōu)勢的發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶［22］；而混菌發(fā)酵的酸奶較單菌發(fā)酵芳香味更濃，溫和不尖酸；相比于市售發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶，德氏乳桿菌和屎腸球菌發(fā)酵的酸奶組織更加緊實，倒杯不灑，具有更加優(yōu)良的感官和滋味。

表3　感官評定結(jié)果Table3 Sensory evaluatioonn

綜上可知，PQ-4菌感官性狀最好，PG-30菌株的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；PG-13菌株的后酸化能力強(qiáng)；通過對球、桿菌的組合，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌株的產(chǎn)酸能力、凝乳效果比單菌株高，后酸化偏弱且趨于穩(wěn)定，感官性質(zhì)更優(yōu)良；市售酸奶多用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌做發(fā)酵劑，制作的酸奶性質(zhì)穩(wěn)定但質(zhì)地較稀薄，需要加入穩(wěn)定劑、增稠劑等，而犏牛酸奶質(zhì)地緊實，香味濃郁，較低溫度發(fā)酵減少成本，獲得質(zhì)地更緊密、濃稠的酸奶，無需再添加增稠劑等，延長貨架期。

3　結(jié) 論

從甘南牧區(qū)采集的3 個發(fā)酵酸乳樣品中初步分離到76 株乳酸菌，其中球菌43 株，桿菌33 株。球菌多以單個、一對或四連體的形態(tài)出現(xiàn)，這可能與當(dāng)?shù)啬撩耖L期以來摸索出的培養(yǎng)條件相關(guān)［26］。篩選出3 株發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌，通過16S rDNA序列同源性分析，鑒定菌株P(guān)Q-4為屎腸球菌（Enterococcus faecium PQ-4）、菌株P(guān)G-13為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii PG-13）、菌株P(guān)G-30為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum PG-30）；其中菌株P(guān)Q-4凝乳感官性狀最好，菌株P(guān)G-30的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；菌株P(guān)G-13的后酸化能力強(qiáng)。

3 株菌在37 ℃和42 ℃溫度條件下發(fā)酵的酸 奶，凝乳狀態(tài)、凝乳時間相差不大，組間差異性不顯著（P＞0.05），且溫度越高凝乳時的酸度值越高。考慮到甘南地區(qū)海拔高溫度低，37 ℃更接近于當(dāng)?shù)啬撩袷褂玫陌l(fā)酵溫度，選擇37 ℃為最佳生長溫度。

由于大眾對功能性酸奶需求的日益擴(kuò)大，篩選具有特殊功能的益生菌也逐漸成為菌種篩選的主要目的［27］，分離所得屎腸球菌是腸道內(nèi)的正常菌群，大量存在于蔬菜、植物材料食品，特別是傳統(tǒng)奶制品中，如奶酪［28］，具有一定的抑菌作用，多耐酸、耐熱且腸道黏附能力強(qiáng)［29-30］。且有研究表明，屎腸球菌通過蛋白質(zhì)分解和脂肪分解作用，產(chǎn)生許多揮發(fā)性物質(zhì)，對奶制品香味的生成有積極作用［28］。犏牛酸奶香味濃郁的原因可能是基于此；而篩選所得的發(fā)酵乳桿菌，傳統(tǒng)上多用于谷物類食品的發(fā)酵生產(chǎn)，屬于異型發(fā)酵乳酸菌。在發(fā)酵食品的制備中也有廣泛應(yīng)用，如在面包、發(fā)酵香腸、酸奶和泡菜等的生產(chǎn)過程中添加［31］。益生菌發(fā)酵可以提高產(chǎn)品的營養(yǎng)狀況，酸度和風(fēng)味也得到了改善，并且產(chǎn)生抗菌物質(zhì)延長了產(chǎn)品保存時間［32］。

基于菌種以上的優(yōu)點，把分離到的球菌屎腸球菌（PQ-4）、德氏乳桿菌（PG-13）、發(fā)酵乳桿菌（PG-30）按照球桿菌互補(bǔ)的原則組合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌株產(chǎn)酸能力、凝乳效果比單菌株高，且凝乳時間、產(chǎn)酸速率優(yōu)于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵酸奶，后酸化偏弱且趨于穩(wěn)定，感官性質(zhì)更優(yōu)良。

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Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Dzo Yogurt in Gannan Pasture Area of China

MA Yuxiao， LI Wei， CHEN Xiaohong， JIANG Mei， RUI Xin， DONG Mingsheng*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

A total of 76 strains of lactic acid bacteria （LAB） were isolated from home-made dzo yogurt samples collected from Gannan pasture region of Gansu province in China. Through fermentation tests， three strains of LAB including 1 strain of cocci and 2 strain of bacillus were screened. By analysis of their 16S rRNA gene sequences， the three strains were identified to be Enterococcus faecium， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum， respectively. Mixed culture fermentation by cocci and bacillus at a ratio of 1：1 showed that faster acidification， lower post-acidification and better sensory property than the individual fermentation.

dzo yogurt； lactic acid bacteria； isolation； fermentation performance

TS25 2.54

A

1002-6630（2015）03-0127-05

10.7506/spkx1002-6630-201503024

2014-01-27

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B01-4）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2011AA100903）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201422）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31371807）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

馬宇瀟（1991—），女，碩士，研究方向為食品微生物。E-mail：2013808096@njau.edu.cn

董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：dongms@njau.edu.cn