顧偉，羅旋，匡勇△

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，上海 200001)

1 引 言

由于創(chuàng)傷、手術(shù)切除、先天畸形等原因?qū)е碌能浗M織缺損，采用組織移植以改善或恢復(fù)生理功能或外形是最重要的治療手段。自體脂肪組織其生物相容性好，質(zhì)地、外形自然而不存在免疫排斥反應(yīng)，是軟組織缺損修復(fù)的最理想材料。但脂肪移植術(shù)后往往在長期觀察中出現(xiàn)脂肪細胞成活率低，移植物組織被吸收等問題。2007年Yoshimura[1]等報導(dǎo)了將脂肪干細胞與脂肪共同移植進行軟組織填充，有效提高了成活率，并將這一技術(shù)命名為細胞輔助的脂肪移植(cell assisted lipotransfer, CAL)。其不足之處是，需要消耗更多的脂肪組織，以獲得脂肪組織中的各種細胞(主要是脂肪間充質(zhì)干細胞，血管內(nèi)皮前體細胞和內(nèi)皮細胞等)。而需要脂肪移植的患者，常不能提供足夠的優(yōu)質(zhì)脂肪量。另外，脂肪細胞作為成體細胞隨著患者年齡的增加其增殖分化能力不斷下降[2]。為此，我們設(shè)計應(yīng)用來源更加廣泛，且無創(chuàng)的臍帶間充質(zhì)細胞來替代脂肪間充質(zhì)細胞，對比研究脂肪干細胞和臍帶間充質(zhì)干細胞在輔助游離脂肪移植中的異同。

2 實驗材料及方法

2.1 實驗材料

本實驗所涉及的臍帶均來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，由無任何基礎(chǔ)疾病產(chǎn)婦提供，4名，25～34歲；脂肪組織來自上海交通大學(xué)仁濟醫(yī)院整形外科，由無任何基礎(chǔ)疾病吸脂求美者提供，6名，27～43歲。所有提供者均知情同意。

本實驗所用裸鼠均來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院動物實驗室，4周齡，雌性。

2.2 實驗方法

我們設(shè)計應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細胞與脂肪組織顆?；旌虾?，移植到裸鼠皮下，與單純脂肪組織移植作對照，不同的時間觀察其在改善組織缺損和轉(zhuǎn)歸及作用機制的異同。

取傳至第3代的臍帶間充質(zhì)干細胞(1x106)制成80 ul稀薄懸液，與脂肪顆粒(0.5ml)混合為實驗組，80 ul培養(yǎng)液與脂肪顆粒(0.5 ml)混合為對照組，在相同條件下移植于裸鼠皮下，經(jīng)一周，一個月，兩個月時間，取出移植物，觀察大體吸收情況，測量移植物重量，血管生成情況，real-time PCR實驗檢測VEGF、PPAR-γ基因表達情況。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本實驗所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0對其進行t檢驗分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 動物實驗結(jié)果

移植第一周后，兩組間移植物的大小和重量沒有明顯改變。1個月時，兩組移植物較1周時縮小，提示有部分被吸收，2個月時，兩組移植物均明顯被吸收(見圖1A)。三個觀測時間點重量的差異沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1B)。

表1 臍帶間充質(zhì)干細胞輔助游離脂肪移植各組移植物重量(單位：g)

圖1 移植物的大體觀及重量

可見1周時兩組移植物未見明顯吸收，大體及重量相近；一個月時，臍帶間充質(zhì)干細胞組移植物重量略高，2個月時，對照組幾乎全部吸收，臍帶間充質(zhì)干細胞組也有大部分被吸收，僅有少量存留。

Fig1Grossappearanceoftransplantatedtissues

There is no obvious change both in control and UCMSCs groups at 1week after transplantation. At 1month and 2months post-transplantation, UCMSCs supplemented grafts are a bit bigger than control group,and the weight are a little higher.

各組移植物取下后立即固定、包埋、切片、HE染色，觀察組織內(nèi)細胞成活及血管生成情況。見圖2。

3.2 Real-time PCR分析

移植物中的VEGF、PPAR-γ基因表達水平通過real-time PCR技術(shù)進行檢測，結(jié)果見圖3。

圖2 移植物組織切片的HE染色兩組移植物脂肪組織改變差異不明顯。物鏡10倍放大。

圖3 移植物中PPAR-γ、VEGF基因表達水平

三個觀測時間點中，兩組間PPAR-γ表達相同，而臍帶間充質(zhì)干細胞組VEGF表達較高。

Fig3Real-timePCRanalysisofthePPAR-γ，VEGFgeneexpression

The UCMSCs group have higher VEGF gene expression, while no difference between the two groups about PPAR-γexpression

各組移植物中的PPAR-γ基因表達顯示，移植后1周，對照組與臍帶間充質(zhì)干細胞成脂轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的表達基本相同，移植后1個月、2個月兩組PPAR-γ基因表達也未見顯著改變，兩組間PPAR-γ基因表達水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3A)。移植后1周，對照組與臍帶間充質(zhì)干細胞組VEGF基因表達水平均較低，無顯著差異；在1個月和2個月時，兩組VEGF表達維持在較低水平，無顯著的改變，對照組與臍帶間充質(zhì)干細胞組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3B)。

4 討論

臍帶間充質(zhì)干細胞是一種原始的間充質(zhì)干細胞，可以在體外條件下穩(wěn)定傳代和凍存復(fù)蘇，而不發(fā)生自發(fā)分化，且可以保持較強的增殖能力[3]。體外經(jīng)化學(xué)試劑和生長因子作用后，可以分化為軟骨、骨和脂肪等中胚層來源的細胞，而且可以轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞等外胚層來源的細胞[4-5]。大部分成體干細胞的增殖分化活力會隨著年齡增長而衰退[6]，但臍帶間充質(zhì)干細胞不存在上述問題，而仍然能夠保持較強的增殖分化能力[7]。同時，臍帶間充質(zhì)干細胞能夠分泌抑制細胞凋亡的生長因子，具有免疫豁免和免疫調(diào)節(jié)的特性，無同種異體免疫排斥反應(yīng)，且儲量豐富，獲取方便，體外培養(yǎng)擴增穩(wěn)定，是臨床應(yīng)用中一種較為理想的干細胞[8]。

本實驗以單純的脂肪移植作為對照，將臍帶間充質(zhì)干細胞和脂肪混合后作為實驗組進行研究，結(jié)果表明，在移植后第一周，兩組移植物均未表現(xiàn)出明顯的吸收；1個月，臍帶間充質(zhì)干細胞組的移植物略高于單純脂肪對照組；2個月的長期觀察中，兩組移植物均有較大程度的吸收，臍帶間充質(zhì)干細胞組移植物重量仍略高于對照組，然而所有觀察時間點兩組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步將兩組移植物內(nèi)血管生長因子VEGF和成脂轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的基因表達進行研究，發(fā)現(xiàn)臍帶間充質(zhì)干細胞并不能顯著提高移植物中VEGF及PPAR-γ的表達，雖然文獻[5]提到臍帶間充質(zhì)干細胞能夠分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、干細胞因子等，然而，我們的研究結(jié)果表明，臍帶間充質(zhì)干細胞對于特定的細胞因子VEGF及轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ基因表達沒有促進作用，提示臍帶間充質(zhì)干細胞不能像脂肪干細胞一樣促進移植物的血管新生和成脂分化。

移植物中脂肪細胞成活的數(shù)量和單個細胞的脂肪含量決定著移植物的體積。其內(nèi)部所含的干細胞成脂分化能力也會對移植物的體積產(chǎn)生影響。有研究證實，臍帶間充質(zhì)干細胞在成脂分化方面的速度要慢于脂肪干細胞，在同等誘導(dǎo)條件下，臍帶間充質(zhì)干細胞需要較長時間才能夠出現(xiàn)脂肪細胞的形態(tài)改變以及完成向成脂細胞的轉(zhuǎn)變過程[9]。上述實驗結(jié)果的原因有可能是由于干細胞本身的組織特異性所致：來源于某一組織的干細胞會一定程度的保留原有組織的特性，某些決定其向原組織細胞分化的基因在誘導(dǎo)之前就已經(jīng)處于預(yù)激活狀態(tài)。脂肪干細胞是脂肪組織內(nèi)具備增殖和分化能力的干細胞，承擔(dān)著脂肪組織內(nèi)成熟脂肪細胞更新的來源，能夠高效的分化為成熟脂肪細胞，本就有較高的成脂分化傾向，其基因組中成脂分化轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ表達較其他組織來源干細胞處于較高水平。本實驗中的臍帶間充質(zhì)干細胞并不能夠促進移植物中PPAR-γ基因表達的明顯增高，而來源于脂肪組織的脂肪干細胞則能夠很好的提高移植物中相關(guān)成脂基因PPAR-γ的表達，說明在干細胞輔助脂肪移植中，其組織來源影響了這些細胞在移植后作用的發(fā)揮。這可能是導(dǎo)致本實驗結(jié)果移植物重量沒有統(tǒng)計學(xué)差異的原因之一。

綜上，臍帶間充質(zhì)干細胞不能夠有效提高移植物重量、成脂以及血管生成的修復(fù)效應(yīng)，其作為脂肪干細胞的替代，用于游離脂肪移植的效果尚不成熟。