王俊紅，問姣，董鵬，張靜，焦楊，郭永紅

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二醫(yī)院腫瘤科，西安 710004； 3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二醫(yī)院感染科，西安 710004)

1 引 言

糖尿病是威脅人類健康的慢性代謝性疾病，糖尿病在中國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，患病率接近10%。治療2型糖尿病口服降糖藥多存在誘發(fā)低血糖、增加體重、胃腸道反應(yīng)及繼發(fā)性失效等缺點[1]，而新型降糖藥胰高血糖素樣肽-l (Glucagon-like peptide-1，GLP-1)及其類似物可以克服以上缺陷，越來越受到重視[2]。Exendin-4是具有良好前景的GLP-1類藥物，適用于二甲雙胍和酰脲類藥物治療不理想的2型糖尿病患者[3-4]。目前的制劑為艾塞那肽注射液,每日皮下注射1-2次，Exendin-4的長效緩釋皮下注射劑正在臨床研究之中[5-7]。雖然Exednin-4 及其長效緩釋制劑是理想的治療糖尿病藥物[8-10]，但是Exendin-4 是僅有39個氨基酸的短肽，大量制備較困難，價格昂貴，因此，有必要以基因工程的方法制備Exednin-4，從而降低生產(chǎn)成本。

腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一種非病原性的復(fù)制缺陷型人類病毒,能夠特異的將其基因定點整合到人基因組19號染色體長臂(19ql3.4)的特定位點(AAVS1)，具有不引起轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)和插入性突變的特點,并能介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的長期表達，成為目前安全性最好的理想基因治療載體[11]。AAV基因組結(jié)構(gòu)簡單(全長僅有4.7 kb)，僅編碼Cap和Rep兩個基因，但是由于AAV為單鏈DNA病毒，由單鏈基因組向有轉(zhuǎn)錄活性的雙鏈形式轉(zhuǎn)變限制了AAV載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。雙鏈DNA的腺相關(guān)病毒(Double-stranded adeno-associated virus, dsAAV)可越過病毒DNA第二條鏈合成限速步驟，從而顯著提高AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。本研

究在已構(gòu)建的可使Exendin-4分泌表達單鏈腺相關(guān)病毒(Single strand adeno-associated virus, ssAAV) 基礎(chǔ)上[12]，構(gòu)建了重組雙鏈AAV(Double-stranded adeno-associated virus, dsAAV)，與單鏈重組病毒在表達效率及分泌Exendin-4濃度比較，為優(yōu)化AAV基因治療研究奠定基礎(chǔ)。

2 材料

2.1 質(zhì)粒與菌株

克隆載體pGEM-T-Easy質(zhì)粒(50 ng/μL)購自Promega公司；pBV220-NT4質(zhì)粒，輔助質(zhì)粒pAAV-Ad，腺病毒全基因組質(zhì)粒pFG140，腺相關(guān)病毒穿梭質(zhì)粒pSSHG-CMV、改造的雙鏈AAV載體及人胚腎293細胞系，大腸桿菌E. coliDH5α菌株等由西安華廣生物工程公司提供。

2.2 工具酶和主要試劑

限制性內(nèi)切酶NaeI、BamH I、EcoR I及TaqDNA聚合酶, T4 DNA連接酶等試劑購自華美生物工程公司。質(zhì)粒小提試劑盒,PCR純化試劑盒,DNA回收試劑，Marker等均購自北京天根公司。Exendin-4酶聯(lián)試劑盒購自Phoenix pharmaceuticals INC公司，小鼠抗Exendin-4 抗體購自美國phoenix pharmaceuticals 公司，引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成。

3 方法

3.1 雙鏈腺相關(guān)病毒重組質(zhì)粒pSSHG/NT4-Exendin-4 表達盒

ssAAV穿梭質(zhì)粒pSSHG/NT4-Exendin-4構(gòu)建已完成[12]，重組AAV質(zhì)粒表達盒見圖1。

圖1 雙鏈腺相關(guān)病毒重組質(zhì)粒pSSHG/NT4-Exendin-4 表達盒

3.2 構(gòu)建dsAAV穿梭質(zhì)粒dspSSHG/Exendin-4

T4連接酶分別將NT4信號肽-Exendin-4 cDNA 和△ITR-polyA片段3個片段連接入線性化的dsAAV載體，獲得重組質(zhì)粒dsAAV/pSSHG/Exendin 4，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切篩選并測序鑒定陽性克隆，篩選到的重組子命名為dsAAV/pSSHG/Exendin-4，同時構(gòu)建表達綠色熒光的報告基因質(zhì)粒dsAAV/pSSHG/GFP。

3.3 重組病毒滴度測定

重組質(zhì)粒dsAAV/pSSHG/Exendin-4、輔助質(zhì)粒pAAV-Ad、腺病毒全基因組質(zhì)粒pFG140三種質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，G418篩陽性轉(zhuǎn)化細胞，收獲并純化重組病毒，收獲的毒種感染293細胞加PBS液冰融細胞，離心取上清，-20℃保存進行病毒滴度測定。取重組病毒回收液100μl,加入蛋白酶K緩沖液100 μl及10 μl蛋白酶K,37℃孵育2 h；酚:氯仿抽提，無水乙醇沉淀，70%乙醇洗沉淀，溶于10 μl TE溶液中；將系列稀釋度的dsAAV/pSSHG/Exendin 4質(zhì)粒及病毒分別點樣于NC膜上；加變性液于濾紙上，將NC膜浸于其上5 min，分別在中和液浸濕的濾紙及6×SSC浸濕的濾紙上5 min，干燥后置80℃ 2 h；NC膜68℃預(yù)雜交30 min；加入變性探針68℃雜交4 h；馬來酸溶液室溫洗NC膜5 min，加入地高辛抗體堿性磷酸酶復(fù)合物混勻, 37℃ 30min，10 ml探測液中漂洗3 min，加入5 ml新配制的顯色液, 37℃溫箱避光反應(yīng)16 h，漂洗、干燥后根據(jù)結(jié)果計算病毒滴度。按Boehringer Mannheim公司試劑盒說明書進行。通過計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)、再乘以與其雜交信號強度一致的病毒液樣品的稀釋倍數(shù)而得出滴度，使用相同的方法包裝表達GFP報告基因的dsAAV病毒并測定AAV滴度。

3.4 表達GFP的AAV轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞

常規(guī)復(fù)蘇NIH3T3細胞；用含10%小牛血清培養(yǎng)基, 37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)；細胞長滿后進行傳代；NIH3T3細胞80%成片后100感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)劑量感染重組病毒pSSHG/GFP，2 h后更換完全培養(yǎng)基，48 h后置熒光倒置顯微鏡下觀察和拍照。

3.5 檢測重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3細胞培養(yǎng)基上清Exendin-4濃度

NIH3T3細胞80%成片后100 MOI劑量感染重組病毒dsAAV/pSSHG/Exendin-4，2 h后更換完全培養(yǎng)基，收集感染后72 h的培養(yǎng)基上清；上清離心后按Phoenix pharmaceuticals INC酶聯(lián)試劑盒說明書測定Exendin-4濃度，每份標準品和標本重復(fù)測3次，取平均值。

3.6 免疫組化檢測重組病毒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞

L-多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，將細胞直接種入，置于37℃5% CO2孵箱培養(yǎng),待80%細胞成片后，分別加入100 MOI重組AAV和等體積PBS, 60 h后取出玻片,丙酮室溫固定15 min；PBS(0.lmol/L,pH7.4)洗3次,每次5 min(以下同), 0.75%H2O2水(40:l)50μl,37℃ 30 min阻斷細胞內(nèi)源性過氧化物酶活性, PBS洗3次；0.5%TritonX-100 50 μl,透膜30 min,PBS洗3次；加入50 μl 20%胎牛血清，37℃濕盒內(nèi)封閉30 min；l:500抗Exendin-4抗體,37℃孵育4 h, PBS洗滌5次；加辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗, 37℃孵育2h,PBS洗3次；0.5 mg/ml二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和0.03%H2O2顯色10 min。

3.7 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析，不同組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學(xué)處理， P<0.05有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

4 結(jié)果

4.1 重組質(zhì)粒pSSHG/Exendin-4鑒定

EcolRI和BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳檢測顯示酶切成pSSHG(7.2kb)片段和NT4-Exendin-4 (376bp)片段(見圖2)。Exendin-4的分泌表達盒測序結(jié)果和數(shù)據(jù)庫序列經(jīng)Blast比對完全一致。

圖2 重組質(zhì)粒pSSHG/NT4-Exendin-4酶切鑒定

Fig2IdentifiedrecombinantplasmidpSSHG/NT4-Exendin-4byrestrictionenzymedigestion

A: pSSHG/Exendin-4/BamHI

B: pSSHG/Exendin-4/EcoRI

C: pSSHG/Exendin-4/EcoRI+BamHI

D: pSSHG/Exendin-4/XbaI E: pSSHG質(zhì)粒

F: DNA Marker 分子量 100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，750bp，1000bp，1314bp，1614bp，2011bp，4.0kb，5.0kb，6.0kb，7.0kb，8.0kb，9.0kb，10.0kb，11kb，12kb，13kb

4.2 重組雙鏈及單鏈腺相關(guān)病毒滴度測定

293T細胞感染重組病毒24 h后局部細胞變圓、脫落，成網(wǎng)狀，出現(xiàn)了明顯的氣球樣變，呈典型感染表現(xiàn)。參照雜交結(jié)果測定出重組病毒的滴度，測定dsAAV/pSSHG/Exendin-4滴度為2.5×1011pfu，較ssAAV/pSSHG/Exendin-4滴度高(2.5×109pfu)。

4.3 表達GFP的重組AAV轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞

使用表達GFP的對照dsAAV轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，與表達GFP的重組ssAAV比較，熒光表達明顯增強(見圖3)。

圖3 表達GFP的重組dsAAV及ssAAV轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞

Fig3ImmunofluorescenceanalysesofGFPindsAAVandssAAV-treatedNIH3T3

4.4 重組病毒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞培養(yǎng)基上清Exendin-4濃度

酶聯(lián)免疫試劑盒檢測dsAAV/pSSHG/Exendin-4感染細胞后上清中Exendin-4的濃度為181.1±8.75 pmol/mg，較ssAAV/pSSHG/Exendin-4組濃度(133.81 ± 8.09 pmol/ml)升高(見圖4)，兩者相比，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

4.5 免疫組織化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染重組病毒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞Exendin-4的表達

重組dsAAV/pSSHG/Exendin-4及ssAAV/pSSHG/Exendin-4轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞72 h，Exendin-4的表達均呈陽性(見圖5)。

圖4EILSA檢測重組病毒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞后上清中Exendin-4濃度(單位：pmol/ml),*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

control組：未轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒的NIH3T3細胞培養(yǎng)基上清

ssAAV組：轉(zhuǎn)染ssAAV/pSSHG/Exendin-4培養(yǎng)基上清檢測

dsAAV組：轉(zhuǎn)染dsAAV//pSSHG/Exendin-4培養(yǎng)基上清檢測

Fig4Exendin-4levels(pmol/ml)assessedbyELISAinthesupernatantofrecombinantplasmid-transfectedNIH3T3cell

圖5免疫組化檢測轉(zhuǎn)染重組dsAAV及ssAAV的NIH3T3細胞Exendin-4表達

A:dsAAV/pSSHG/Exendin-4轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞 (20×10)

B:ssAAV/pSSHG/Exendin-4轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞(20×10)

Fig5HistologicalandimmunohistochemicalanalysesofExendin-4indsAAVandssAAV-treatedNIH3T3

5 討論

AAV是直徑約26 nm的無包膜二十面體病毒顆粒，微小病毒科依賴病毒屬成員之一[13]。AAV不但安全性好，而且宿主范圍廣泛；能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因長期穩(wěn)定表達，因此，是目前在基因治療中最受歡迎的病毒載體之一，其中AAV2應(yīng)用最為廣泛[14]。AAV2 基因組是4.7kb的單鏈線性 DNA，由反向末端重復(fù)序列(Inverted terminal repeats, ITRs)和兩個開放式閱讀框架(open reading frames, ORFs)構(gòu)成。為保證重組腺相關(guān)病毒載體的安全性，研究者僅保留了DNA復(fù)制和病毒包裝所必需的ITRS。ITRs 是AAV的順式作用元件，提供AAV DNA的復(fù)制起始位點和互補鏈合成的引物。因此，AAV不具有定點整合的能力，而是以染色體外附加體(Extrachromosomal elements)的形式存在于宿主細胞核中[15]。但是AAV自身攜帶能力有限，不適用于大分子蛋白的基因傳遞，進入機體細胞后，需要將自身的單鏈復(fù)制成雙鏈才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，因此，很難在應(yīng)用后迅速發(fā)揮作用。dsAAV的工作原理是將AAV包裝系統(tǒng)中載體質(zhì)粒的一側(cè)的D序列去掉后，在復(fù)制過程中，復(fù)制中間產(chǎn)物就不能被切割，所以，最終復(fù)制產(chǎn)物為比載體基因組長一倍且經(jīng)自身互補而成為雙鏈的AAV基因組，并最終被包裝入AAV衣殼中，得到攜帶雙鏈基因組的AAV載體[16]。dsAAV進入細胞后可以直接表達，而且表達水平相對較高，對于糖尿病等慢性疾病而言，非常適合應(yīng)用在目的基因的治療方案中[17]。我們設(shè)想以dsAAV為載體，實現(xiàn)Exendin-4體內(nèi)長期、穩(wěn)定表達，達到理想的治療糖尿病的目的。

本研究中構(gòu)建的dsAAV利用△ITR的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使兩個反向互補的表達盒自互補成雙鏈，進入細胞后立即啟動表達，因此提高了表達效率。為了便于觀察融合基因的表達，用GFP代替Exendin-4的基因序列構(gòu)建對照載體，可通過觀察GFP表達來證實單鏈及雙鏈AAV表達。dsAAV感染NIH3T3細胞熒光表達強度明顯提高，證實dsAAV的表達效率較ssAAV提高。EILSA檢測同樣證實dsAAV系統(tǒng)可使Exendin-4在NIH3T3細胞上清分泌表達量提高，與ssAAV相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。免疫組化檢測也證實dsAAV及ssAAV均可使Exendin-4在NIH3T3細胞表達，說明本實驗構(gòu)建的重組AAV可以在真核細胞內(nèi)分泌表達Exendin-4。

本實驗中選用AAV載體作為基因治療載體，在已構(gòu)建的ssAAV分泌表達Exendin-4的基礎(chǔ)上，構(gòu)建、包裝的重組dsAAV濃縮后滴度可達2.5×1011pfu，具有感染能力，轉(zhuǎn)染細胞后可持續(xù)穩(wěn)定的分泌表達目的基因Exendin-4，提高治療基因的表達效率，為進一步通過動物實驗研究Exendin-4基因在糖尿病治療過程中的效果打下基礎(chǔ)。

(王俊紅，問姣對本研究具有相同貢獻。)