毛永強(qiáng)， 李 娜， 毛 晶

(1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院,遼寧阜新 123000;2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)安全科學(xué)與工程學(xué)院,礦山熱動(dòng)力災(zāi)害與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧阜新 123000;3.天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,天津市材料復(fù)合與功能化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300072)

新霉素(Neomycin，NEO)是一種對(duì)革蘭陽性及陰性菌具有較好抗菌作用的氨基糖甙類抗生素，已廣泛用于治療角膜炎、結(jié)膜炎、眼瞼炎等疾病[1]。目前，新霉素的測(cè)定方法有微生物檢定法[2]、分光光度法[3]、高效液相色譜法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]等。但這些方法存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、多使用有機(jī)溶劑等問題，因此建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏檢測(cè)新霉素含量的方法是十分必要的。

量子點(diǎn)(Quantum Dots，QDs)具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄且對(duì)稱、尺寸可調(diào)、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)良性能，以其為熒光探針建立的熒光分析技術(shù)，已廣泛用于生物標(biāo)記、藥物分析等領(lǐng)域[6 - 8]。本文采用水熱法制備巰基乙酸修飾的CdTe QDs，基于新霉素對(duì)CdTe QDs的熒光增敏效應(yīng)，以CdTe QDs為熒光探針，建立了一種測(cè)定新霉素含量的熒光分析新方法。考察了緩沖體系及pH值、量子點(diǎn)濃度、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)新霉素測(cè)定的影響。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏，用于滴眼液樣品中新霉素含量測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(jì)，U-3310型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；90-3型恒溫雙向磁力攪拌器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司)；3-30K 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國，西格瑪有限公司)。

新霉素(NEO，中國藥品生物制品檢定所)；碲粉(100目，99.999%)，NaBH4(99%)，CdCl2·2.5H2O(>98%)，巰基乙酸(>98%)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水溶性CdTeQDs的制備參考文獻(xiàn)方法[9]制備巰基乙酸修飾的CdTe QDs。準(zhǔn)確稱取0.047 g NaBH4和0.080 g碲粉于反應(yīng)瓶中，加入3.0 mL二次蒸餾水溶解，室溫反應(yīng)至黑色碲粉完全消失，得到紫色透明的NaHTe水溶液。在250 mL三口燒瓶中加入0.286 g CdCl2，用100 mL二次蒸餾水溶解，磁力攪拌下加入220 μL巰基乙酸，用1.0 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11.2，通N2除氧30 min后，在劇烈攪拌下加入新制備NaHTe溶液，100 ℃水浴回流2 h，得到橙紅色水溶性CdTe QDs。

1.2.2新霉素的測(cè)定在10 mL比色管中，依次加入1.5 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)，1.0 mL CdTe QDs溶液及一定量的新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。室溫下放置5 min后，以330 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，測(cè)定體系520 nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度△F=F-F0。式中，F(xiàn)為加入新霉素溶液所測(cè)得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為空白溶液的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe QDs與新霉素的相互作用

圖1為水熱法制備巰基乙酸修飾的CdTe QDs的紫外-可見吸收光譜(曲線a)和熒光發(fā)射光譜(曲線b)。結(jié)果顯示，所制備CdTe QDs的最大吸收波長(zhǎng)在500 nm處，量子點(diǎn)的粒徑和濃度依據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式[10]：D=(9.8127×10-7)λ3-(1.7147×10-3)λ2+1.0064λ-194.84和A=εcl計(jì)算。其中，D為量子點(diǎn)尺寸，λ為量子點(diǎn)第一吸收峰波長(zhǎng)，A為量子點(diǎn)在第一吸收峰的吸光度值，ε為量子點(diǎn)摩爾吸光系數(shù)，c為量子點(diǎn)摩爾濃度，l為光路長(zhǎng)度。計(jì)算得出CdTe QDs的粒徑為2.4 nm，濃度為3.5×10-6mol·L-1。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm時(shí)，CdTe QDs的熒光發(fā)射峰位于520 nm處，半峰寬窄而對(duì)稱，表明該量子點(diǎn)具有優(yōu)良的熒光性能。

在CdTe QDs溶液中分別加入不同濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察新霉素濃度對(duì)CdTe QDs熒光光譜的影響，如圖2所示。結(jié)果表明，隨著新霉素濃度的增加，CdTe QDs熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且新霉素濃度在一定范圍內(nèi)與體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F呈一定的線性關(guān)系，據(jù)此建立基于CdTe QDs熒光增敏法測(cè)定新霉素的方法。

圖1 CdTe量子點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)

圖2 新霉素濃度對(duì)CdTe QDs熒光光譜的影響；插圖為新霉素-CdTe QDs的校正曲線

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.2.1反應(yīng)介質(zhì)及pH值的選擇分別以相同pH值的Tris-HC、磷酸緩沖溶液和硼酸-硼砂緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)，考察不同緩沖溶液對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Tris-HCl緩沖溶液中，體系熒光增敏作用最大且穩(wěn)定。另外考察不同pH值Tris-HCl緩沖溶液對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F的影響(圖3)。結(jié)果表明，體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F隨著Tris-HCl緩沖溶液pH值增大而變化；當(dāng)pH值為7.5時(shí)，△F達(dá)到最大。因此實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)介質(zhì)為pH值7.5的Tris-HCl緩沖溶液。

2.2.2CdTeQDs濃度的選擇考察了不同濃度CdTe QDs對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F的影響,如圖4所示。結(jié)果表明，隨著CdTe QDs濃度的增加，體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F逐漸增大；當(dāng)CdTe QDs濃度為3.5×10-6mol·L-1時(shí)，△F達(dá)到最大。因此實(shí)驗(yàn)選擇CdTe QDs的濃度為3.5×10-6mol·L-1。

圖3 pH值對(duì)△F的影響

圖4 CdTe QDs濃度對(duì)△F的影響

2.2.3反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性的選擇考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F逐漸增大；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到5 min，△F達(dá)到最大且在30 min內(nèi)保持不變。因此實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.3 工作曲線與檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別取不同濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一定濃度的CdTe QDs溶液中，在330 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定體系在520 nm處的熒光強(qiáng)度，且以新霉素濃度(c)為橫坐標(biāo)，體系相對(duì)熒光強(qiáng)度(△F)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新霉素濃度在1.0×10-8～10.0×10-8mol·L-1范圍內(nèi)與體系相對(duì)熒光強(qiáng)度△F呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：△F=-0.22732+16.28546c(×10-8mol·L-1)，相關(guān)系數(shù)r為0.9996，方法檢出限(3SD/k)為2.6×10-10mol·L-1(SD為11份空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為工作曲線的斜率)。

2.4 共存物質(zhì)的影響

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了滴眼液中常見輔料及離子對(duì)測(cè)定5.0×10-8mol·L-1新霉素含量的影響。允許相對(duì)誤差為±5%，100倍的H3BO3、NaCl、水楊酸乙酯和50倍的硼砂對(duì)新霉素?zé)晒鉁y(cè)定均不產(chǎn)生影響，表明該方法對(duì)新霉素具有較好選擇性。

2.5 樣品測(cè)定及回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取一定量新霉素滴眼液至10 mL比色管中，用二次蒸餾水稀釋至刻度。按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定新霉素含量；同時(shí)加入已知量的對(duì)照品新霉素溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，樣品測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.42%～2.51%，加標(biāo)回收率在97.4%～103.4%之間，表明此方法可用于新霉素含量的定量檢測(cè)。本方法與高效液相色譜法相比，操作簡(jiǎn)單、快速，且避免使用有機(jī)溶劑；與微生物檢定法、分光光度法等方法相比，穩(wěn)定性好、檢出限更低。

表1 樣品中新霉素的測(cè)定結(jié)果及回收率(n=6)

3 結(jié)論

本文以巰基乙酸修飾的CdTe QDs為熒光探針，建立了一種測(cè)定新霉素的熒光分析新方法。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，新霉素濃度在一定范圍內(nèi)與體系相對(duì)熒光強(qiáng)度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)和檢出限分別為0.9996和2.6×10-10mol·L-1。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，并成功用于滴眼液樣品中新霉素含量的分析測(cè)定。