黃可兒　王琴　管鴿　陳卓美

139株結核分枝桿菌耐藥性分析及耐藥基因檢測

黃可兒王琴管鴿陳卓美

目的 了解本地區(qū)結核分支桿菌菌株的耐藥狀況，建立適合本地區(qū)結核分支桿菌耐藥株的快速檢測手段。方法 2013年5月至9月143例患者的痰液標本中獲得的結核分支桿菌，分離培養(yǎng)獲得試驗菌株139株，進行菌株鑒定和藥物敏感實驗，并從中隨機抽取12株菌株，利用試劑盒MTBDR-plus（德國HAⅠN Lifescience）進行rpoB、katG及inhA基因檢測。結果 139株結核分枝桿菌復合群菌株中，對4種一線抗結核藥物的總體耐藥率為19.58%，其中17株（12.23%）至少對ⅠNH耐藥，12株（8.63%）至少對RFP耐藥，15株（10.79%）至少對SM耐藥，3株（2.16%）至少對EMB耐藥。在隨機抽取的12株菌株中，耐藥基因檢測結果與藥物敏感試驗作比較，結果顯示兩組數(shù)據(jù)結果大致相符。結論 耐多藥結核菌株增多，應迅速建立準確快速的藥物敏感性檢測方法。試劑盒MTBDR-plus值得推廣。

結核分枝桿菌 耐多藥 耐藥基因 HAⅠN

結核?。═B）是由結核分枝桿菌感染引起的人畜共患的嚴重傳染病，結核病的病死率在全球范圍內均有上升的趨勢［1］。異煙肼（INH）、利福平（RFP）、鏈霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）作為一線抗癆藥，其耐藥性的出現(xiàn)，對感染耐藥性結核桿菌患者的治療帶來較大困難。進行TB耐藥和耐多藥的分析研究，對控制耐藥和耐多藥結核病有重要意義［2］。結核分枝桿菌耐異煙肼的產生是與過氧化氫酶—過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關，和inhA基因突變也有相關性；結核分支桿菌耐利福平與其核心區(qū)域rpoB基因突變有關［3，4］。本實驗采用藥物敏感試驗，觀察本地區(qū)的結核耐藥情況，同時利用試劑盒MTBDR-plus［5］進行rpoB、katG及inhA基因檢測，比較兩種方法，從而為臨床治療提供可靠依據(jù)。

1　臨床資料

1.1一般資料 2013年5月至9月從本院143例結核病患者的痰標本中獲得的結核桿菌做分枝桿菌分離培養(yǎng)檢測，其中男93例，女50例；年齡13～86歲，中位年齡48歲。對143株進行菌型初步鑒定，其中139株（97.2%）屬于結核分枝桿菌復合群， 4株（2.8%）屬于非結核分枝桿菌，未作進一步的具體菌種分類鑒定。

1.2試劑與儀器 酸性改良羅氏（L-J）培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基（上海市肺科醫(yī)院配制），MTBDR plus試劑盒（德國Hain Lifescience）；GT-Blot 20全自動雜交儀（德國Hain Lifescience）、PCR儀（德國Biometra公司）。結核分枝桿菌標準菌株H37Rv由上海市肺科醫(yī)院提供。

1.3方法 （1）痰標本去污染處理：對照患者姓名挑取約5ml標本至50ml已標記的密封帶螺旋帽離心管中，加等量2%NALC-NaOH標本前處理液，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，直至痰充分液化，靜置15min。再加入無菌PBS（pH6.8）至40ml，蓋緊蓋子，上下混勻。放入帶內密封的離心機（L550低速離心機）內，3000g離心15min，吸掉上清液。添加1ml PBS（pH6.8）以中和PH，約1～2 min，混勻備用。（2）分離培養(yǎng)：分別將抗酸染色陽性的痰標本，每份標本同時接種2只L-J培養(yǎng)基。取接種后的改良羅氏培養(yǎng)基置恒溫培養(yǎng)箱（GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱），（36±1）℃斜面水平孵育。待24h后，將培養(yǎng)基直立放置，（36±1）℃下繼續(xù)孵育。觀察2次/周，有菌落生長者，抗酸染色確認后報告“分枝桿菌培養(yǎng)陽性”。（3）藥物敏感試驗：本實驗采用絕對濃度法［6，7］，每種藥物測試低、高兩種濃度。4種一線抗結核藥物的培養(yǎng)基內最終濃度分別為：INH：1μg/ml，10μg/ml；RFP：50μg/ml，250μg/ml；SM：10μg/ml，100μg/ ml；EMB：5μg/ml，50μg/ml。首先制備1 g/L菌懸液，稀釋至10mg/L，用微量吸管接種0.1ml至對照及含藥培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)4周后報告結果。低濃度含藥培養(yǎng)基未生長分枝桿菌報告敏感（S），有生長報告耐藥（R）。耐藥的判定標準：對照培養(yǎng)基菌落生長良好，含藥培養(yǎng)基上菌落＞20個為耐藥，含藥培養(yǎng)基上無菌落生長為敏感，菌落介于l～20個時重新檢測。在本資料中，當?shù)蜐舛饶退帟r，認為測試菌株對該藥物具有耐藥性。（4）試劑盒MTBDR-plus（德國HAIN Lifescience）方法：①DNA提取：用接種環(huán)收集固體培養(yǎng)基上生長的細菌，浸入約300μl去離子水使之懸浮，95℃水浴孵育20min，超聲波水浴15min，緩慢減速5min，取上清5μl進行PCR。②復合擴增：反應體系包含35μl引物核苷酸混合物，5μl 10×擴增緩沖液，2μl 25 mmM MgCl2 緩沖液，1 U熱啟動Taq聚合酶以及5μl DNA模板，總反應容積為50μl，整個過程嚴格按照操作手冊進行。③雜交顯色：根據(jù)MTBDR plus試劑盒的操作說明，生物素標記的PCR產物進行化學變性后與特異性的寡核苷酸探針進行雜交，再通過堿性磷酸酶促反應顯色。④探針排列與檢測方案：探針采用以下3種方案對DNA條帶進行控制。第1種探針：與23S rRNA 基因（tub）的結核分支桿菌特異區(qū)段互補，故會使所有結核分支桿菌株顯示陽性。若TUB區(qū)域陰性，檢測的細菌就不屬于結核分枝桿菌。第2種探針：作為內對照，由于同源性結合與底物著色正確進行時發(fā)生線形延伸，若擴增正確進行則顯示陽性。第3種探針（3類）：3類探針分別特異性與rpoB，katG 和inhA基因互補，進行位點控制，當TUB提示是結核分支桿菌時會顯示為陽性：8個rpoB野生型探針包含了編碼505至534.4位氨基酸的rpoB 基因區(qū)段，其他探針特異性識別大部分常見突變：D516V、H526Y、H526D和S531L。

1.3統(tǒng)計學分析 患者的基本資料來源于本院實驗室信息管理系統(tǒng)（LIS），標本的實驗室檢測數(shù)據(jù)來自試驗記錄，數(shù)據(jù)整理使用Microsoft Excel。

2　結果

2.1藥物敏感試驗結果 見表1。

表1　139株結核分枝桿菌對4種一線抗結核藥物的耐藥情況

2.2139株結核分枝桿菌對4種一線抗結核藥物的耐藥情況 見表2。

表2　139株結核分枝桿菌對4種一線抗結核藥物的耐藥情況

2.3試劑盒MTBDR-plus：隨即抽取12株菌株，具體數(shù)據(jù) 見表3。

表3　隨機抽取12株菌株兩種方法結果數(shù)據(jù)

3　討論

目前治療TB主要使用化學藥物，然而由于抗結核藥物的不規(guī)范治療，病人體內的結核菌對多種抗結核藥物發(fā)生耐藥，從而形成耐多藥結核?。∕DR-TB），這是TB疫情重新上升的最主要的原因之一。近年來我國TB耐藥狀況的研究越來越多，不同地區(qū)之間存在著一定的差異。本市主要耐藥類型為異煙肼、利福平和鏈霉素為主，患者中男性比例明顯高于女性。單耐藥、多耐藥和耐多藥結核菌株比例相當，和以往數(shù)據(jù)相比，多耐藥以及耐多藥比例升高，數(shù)量增加，因此監(jiān)測患者的耐藥性更顯得重要。

結核分枝桿菌培養(yǎng)周期長，耐藥結核分枝桿菌生長更為緩慢，目前，尚無方法能直接鑒定分枝桿菌臨床標本。國內多采用藥物敏感試驗和基因方法對菌株做耐藥性檢測，而基因方法使用較多。常規(guī)的基因檢測方法因其簡便、快速，已被大家廣泛研究和應用，但是，隨著耐藥基因的不斷出現(xiàn)，需檢測的基因數(shù)量越來越多，尤其是多耐藥結核桿菌的出現(xiàn)，使得檢測顯得較為繁瑣。由于條件所限本資料僅對12株結核分枝桿菌的rpoB、katG及inhA基因進行了檢測，檢測結果與藥物敏感試驗結果有較好的重復性，1號患者菌株野生型rpoB基因探針檢出ΔWT7；MUT1突變，藥敏試驗利福平為敏感，考慮其原因可能是由于該突變并非利福平耐藥特異突變位點，也有可能由于藥敏結果不準確所致［8］。

1 汪保國，陳思東，周衛(wèi)平，等.結核桿菌對異煙肼藥物的敏感性試驗.中國實用醫(yī)藥雜志，2008，12（3）：36.

2 中國防癆協(xié)會.耐藥結核病化學治療指南（2009）.中華結核與呼吸雜志，2010，33（7）：485～497.

3 WilliamsD，Waguespack C. Characterization of rifampin in pathogenic mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother，1994，38（2）：2380.

4 Uys PW， Warren R. Potential of rapid diagnosis for controlling drug susceptible and drugresistant tuberculosis in communities where Mycobacterium tuberculosis infections are highly prevalent. J Clin Microbial， 2009， 47（5）：1484.

5 Patel JB，Leonard DG，Pan X，et al. Sequence-based identification of mycobacterium species using the Microseq 500 16S rDNA bacterial identification system. J Clin Microbial，2000，38（1）：246～251.

6 中華醫(yī)學會.臨床技術操作規(guī)范·結核病分冊.北京：人民軍醫(yī)出版社，2004.

7 World Health Organization.Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis. Geneva，Switzerland：WHO，2006.

8 劉敬華，張麗水，劉志廣，等.結核分枝桿菌利福平耐藥基因rpoB突變特征初步分析.中華流行病學雜志，2006，27（11）：973～976.

311800浙江省諸暨市人民醫(yī)院