孫志彬，井歡，李璐璐，王哲，劉春英

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，遼寧 沈陽(yáng)110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110847

補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549荷瘤小鼠脾組織Fas蛋白表達(dá)的影響

孫志彬1，井歡2，李璐璐1，王哲2，劉春英2

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，遼寧 沈陽(yáng)110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110847

目的：研究補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549荷瘤小鼠脾組織中Fas蛋白表達(dá)的影響。方法：建立A549荷瘤小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)對(duì)照法將30只BALB/c小鼠分為正常組、空白對(duì)照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組，除正常組外，余組荷瘤，成功后，每天灌胃相應(yīng)藥物1次，連續(xù)10天后取材。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)脾組織中Fas蛋白的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄-多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)脾組織中Fas的mRNA表達(dá)。結(jié)果：正常組中Fas蛋白在細(xì)胞膜有表達(dá)，空白對(duì)照組出現(xiàn)較多棕黃色顆粒，與正常組比較，F(xiàn)as表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后，F(xiàn)as蛋白表達(dá)減少，與空白對(duì)照組比較，中藥低劑量組、西藥組Fas表達(dá)明顯下降（P＜0.05），中藥高劑量組下降最顯著（P＜0.01）。中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組比較，F(xiàn)as表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。與正常組比較，空白對(duì)照組Fas的mRNA的表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）；經(jīng)補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后，F(xiàn)asmRNA的表達(dá)減少，中藥高劑量組、中藥低劑量組及西藥組與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），而該3組的FasmRNA的表達(dá)與正常組無(wú)明顯差異。結(jié)論：補(bǔ)中益氣湯可下調(diào)A549荷瘤小鼠脾臟中Fas蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷。

補(bǔ)中益氣湯；Fas蛋白；A549細(xì)胞株；脾組織

Fas是體內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的糖蛋白分子，除維持正常生理功能與生存繁殖外，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也有顯著意義［1］。補(bǔ)中益氣湯可用于晚期肺癌的患者，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，其中成分非常復(fù)雜，可調(diào)節(jié)免疫功能［2］，有改善肺部通氣，治療癌性發(fā)熱，緩解癌性疼痛，調(diào)節(jié)精神狀態(tài)等作用［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在研究補(bǔ)中益氣湯對(duì)荷瘤小鼠脾組織免疫分子Fas水平的影響，從分子水平探討補(bǔ)中益氣湯調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能從而達(dá)到抗腫瘤效果的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：scxk（京）2011-0011；人肺腺癌A549細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科院腫瘤研究中心細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 儀器與試劑Fas抗體購(gòu)于武漢博士德（批號(hào)：08G02）；RIPA裂解液購(gòu)于北京鼎國(guó)（批號(hào)：WB-0071）；熒光定量PCR儀購(gòu)于ABI公司。

1.3 藥物 順鉑注射液（DDP，生產(chǎn)批號(hào)2030132DB山東齊魯醫(yī)藥公司）；補(bǔ)中益氣湯方（黃芪、白術(shù)、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當(dāng)歸）購(gòu)于遼寧省中醫(yī)院。

1.4 制備補(bǔ)中益氣湯煎劑 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定補(bǔ)中益氣湯的用藥劑量（處方：黃芪18 g，白術(shù)、甘草各9 g，陳皮、升麻、柴胡、人參各6 g，當(dāng)歸3 g），并通過(guò)《人和動(dòng)物之間按體表面積折算的等效劑量比值表》，計(jì)算出小鼠等效劑量，分設(shè)高、低劑量，即5.82 g/kg（生藥）、1.46 g/kg（生藥）常規(guī)煎煮，煎至終濃度為每毫升含生藥2.33 g，常規(guī)煎煮3次，濃縮成1 kg/L的補(bǔ)中益氣湯煎液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動(dòng)物分組與處理BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分成5組，每組6只（雌雄各半）。除正常組外，其余小鼠均于腋下注射A549細(xì)胞懸液0.2m L（密度為2×108/L），5天后，觀察小鼠腋下有米粒狀突起，開始用藥。具體用量為：正常組：生理鹽水灌胃，0.5m L/只，每天2次，連續(xù)10天；空白對(duì)照組：生理鹽水灌胃，0.5m L/只，每天2次，連續(xù)10天；中藥低劑量組：低劑量補(bǔ)中益氣湯灌胃，0.5m L/只，每天2次，連續(xù)10天；中藥高劑量組：高劑量補(bǔ)中益氣湯灌胃，0.5m L/只，每天2次，連續(xù)10天；西藥組：順鉑腹腔注射，1.38m g/m2，每天1次，連續(xù)3天。于第10天，灌胃后2 h取材。

1.6 免疫組化測(cè)定各組脾組織Fas蛋白的表達(dá) 組織塊石蠟包埋后切片，常規(guī)脫蠟至水，EDTA抗原熱修復(fù)（95℃水浴30 min），3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)原性過(guò)氧化物酶20m in，10%山羊血清封閉20m in，滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜，取出后恢復(fù)至室溫，二抗作用30m in，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，脫水，中性樹膠封片。結(jié)果判定：以細(xì)胞核周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄各自的平均光密度值，作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測(cè)定各組脾組織Fas的mRNA表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書采用Trizol一步法，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Fas引物序列：上游引物5'-GAATG CAAGGGACTGATAGC-3'，下游引物5'-TGGTTCGTGTGCA AGGCTC-3'；內(nèi)參序列：上游引物5'-CCAACCGTGAAAAG ATGACC-3'，下游引物5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'；25μL反應(yīng)體系，預(yù)變性94℃1m in，退火60℃1m in，延伸72℃2m in，循環(huán)35次。余按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度與內(nèi)參的吸光度比值表示該基因表達(dá)強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組Fas蛋白表達(dá)比較 見表1。正常組中Fas蛋白在細(xì)胞膜有表達(dá)，空白對(duì)照組出現(xiàn)較多棕黃色顆粒，與正常組比較，F(xiàn)as表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后，F(xiàn)as蛋白表達(dá)減少，與空白對(duì)照組比較，中藥低劑量組、西藥組Fas表達(dá)明顯下降（P＜0.05），中藥高劑量組下降最顯著（P＜0.01）。中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組比較，F(xiàn)as表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

2.2 各組Fas mRNA表達(dá)比較 見圖1。與正常組比較，空白對(duì)照組Fas的m RNA的表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）；經(jīng)補(bǔ)中益氣湯及順鉑作用后，F(xiàn)as m RNA的表達(dá)減少，中藥高劑量組、中藥低劑量組及西藥組與空白對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），而該3組的Fasm RNA的表達(dá)與正常組無(wú)明顯差異。

表1 各組Fas蛋白表達(dá)比較±s）

表1 各組Fas蛋白表達(dá)比較±s）

與正常組比較，①P＜0.05；與空白對(duì)照組比較，②P＜0.01，③P＜0.05

組別正常組空白對(duì)照組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 Fas蛋白表達(dá)（平均光密度值）0.10±0.039 0.20±0.047①0.11±0.048②0.13±0.042③0.14±0.043③

圖1 各組Fas m RNA表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，正氣內(nèi)虛，臟腑失調(diào)是肺癌發(fā)病的基礎(chǔ)。由于正氣不足，邪氣趁虛而入，阻滯胸中，肺失宣降，氣機(jī)不調(diào)，血瘀于絡(luò)，且津液疏布不利，凝結(jié)成痰，痰瘀互結(jié)成塊。至于晚期，患者均有不同程度的咳嗽咳痰，氣短乏力，消瘦，面色無(wú)華等癥狀，中醫(yī)辨證屬肺脾氣虛，病位在肺，治療當(dāng)“虛則補(bǔ)其母”，培土生金，健脾益氣。目前，臨床治療多以放化療為主，取得一定療效的同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫功能造成損傷，因此提高機(jī)體的免疫能力也是治療過(guò)程的關(guān)鍵。有研究證明，補(bǔ)中益氣湯可以上調(diào)脾虛小鼠的免疫功能，主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞增殖能力有明顯提高［4］。

Fas也稱CD95，APo-1，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）受體超家族成員。在不同組織中表達(dá)不同，具有明顯差異性。在機(jī)體內(nèi)，F(xiàn)as可以與其配體FasL結(jié)合，啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使表達(dá)Fas的細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白降解，并最終使其凋亡。而惡性腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)Fas的配體FasL的表達(dá)，與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tum or Infiltrating Lymphocytes，CTL）表面的Fas結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致CTL凋亡，該現(xiàn)象被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫反攻擊從而逃避免疫監(jiān)視的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，把高表達(dá)FasL的腫瘤細(xì)胞與人T細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的凋亡比例明顯上升，證實(shí)了上述現(xiàn)象［5］。而使用FasL中和抗體，通過(guò)封閉腫瘤細(xì)胞表面的FasL，可以使免疫系統(tǒng)得到有效保護(hù)［6］。

基于上述，筆者對(duì)補(bǔ)中益氣湯影響A549荷瘤小鼠脾組織的Fas表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，對(duì)照組小鼠脾組織中的Fas表達(dá)明顯升高，而高劑量補(bǔ)中益氣湯可明顯下調(diào)荷瘤小鼠脾組織的Fas表達(dá)；在基因檢測(cè)方面，高劑量補(bǔ)中益氣湯下調(diào)Fasm RNA的作用明顯。該研究提示，補(bǔ)中益氣湯有一定的抗腫瘤作用，該作用可能與下調(diào)T細(xì)胞Fas表達(dá)，減少其凋亡有關(guān)，可推廣用于晚期肺癌的輔助用藥。對(duì)于補(bǔ)中益氣湯抗腫瘤、提高免疫功能的機(jī)制值得進(jìn)一步進(jìn)行研究。

［1］Le Deist F，Emile JF，Rienx-Lancat F，et al.Clinical，immunological and pathological consequences of Fas deficient conditions［J］.Lancet，1996，348：719.

［2］季宇彬.中藥復(fù)方化學(xué)與藥理［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：315-322.

［3］李瑞池.補(bǔ)中益氣湯治療晚期肺癌的體會(huì)［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，15（3）：343-344.

［4］羅晶，顧紅纓，徐國(guó)憲.補(bǔ)中益氣湯對(duì)脾虛小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（17）：2613-2615.

［5］Zhang W，Ding EX，Wang Q，et al.Fas ligand expression in colon cancer：A possible mechanism of tum or immune privilege［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，11（23）：3632-3635.

［6］向青，徐波，徐梅.Fas/FasL途徑介導(dǎo)的人肺癌細(xì)胞免疫逃逸［J］.中國(guó)病理生理雜志，2006，22（1）：168-171.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Effect of Buzhong Yiqi Decoction on Fas Protein Expression in Splenic Tissue of A549 Tumor Bearing Mice

SUN Zhibin，JING Huan，LI Lulu，et al

Objective：To investigate the effect of Buzhong Yiqi Decoction on the protein expression of Fas in splenic tissue of A549 tum or bearing m ice.Methods：Lung cancer A549 mouse model was established for anti-lung cancer experiment.Thirty BALB/c mice were randomly divided into normal group，blank control group and high-dose Chinese medicine（CM）group，low-dose CM group，and western medicine group.Mice were given corresponding drug by intragastric administration for ten continuous days.Fas protein expression analyzed by immunohistochemistry（IHC），and Fas m RNA content was analyzed by reverse transcription polym erase chain reaction（RT-PCR）.Results：The protein and expression the content of m RNA of Fas were significantly increased in blank control group（P＜0.01 com pared with the normal group）.Com pared with the blank control group，the protein expression of Fas was decreased in low-dose CM group，CM high-dose group and western medicine group（P＜0.05，P＜0.01）.No statistical significant differences of Fas m RNA expression were found among the medication groups（P＞0.05）.Conclusion：Buzhong Yiqi Decoction can promote the immune system to attack the lung cancer cell by decreasing Fas protein expression in splenic tissue of A549 tumor bearing mice.

Buzhong Yiqi Decoction；Fas protein；A549 cell lines；Spleen

R285.5

A

0256-7415（2015）02-0227-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.106

2014-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072743）；遼寧省教育廳項(xiàng)目（L2010355）

孫志彬（1981-），男，在讀碩士研究生，研究方向：中藥抗腫瘤。

井歡，E-mail：huanj99@163.com。