陳樹越，徐楊，潘艷，羅明志，曾慧龍,鄧林紅△

(1.常州大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，常州 213164) (2.常州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州市呼吸醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213164)

1 引 言

肌動(dòng)蛋白聚合形成的微絲纖維，有時(shí)也稱為應(yīng)力纖維，是成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架的重要組成部分，對(duì)細(xì)胞變性、組織缺損以及創(chuàng)傷修復(fù)等具有十分重要的作用[1-3]。因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲纖維的形態(tài)學(xué)進(jìn)行定量化的表征和分析在研究這類細(xì)胞的物理行為中具有重要意義。

目前，研究者們對(duì)成纖維細(xì)胞等的生物學(xué)行為及其在組織創(chuàng)傷修復(fù)等臨床應(yīng)用方面進(jìn)行了大量的研究工作。例如Kim等做了關(guān)于脂肪來源的干細(xì)胞(ADSC)是否對(duì)人類皮膚成纖維細(xì)胞分泌影響的研究，通過實(shí)驗(yàn)證明了ADSC能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌，適合運(yùn)用于皮膚的創(chuàng)傷恢復(fù)[4]。邢幫榮等進(jìn)行了表皮生長(zhǎng)因子與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的比較研究，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)面修復(fù)中、晚期使用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化[5]。相對(duì)而言，對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲纖維形態(tài)的定量化研究近年來才越來越受到研究者們的重視。例如Comin等人提出了一套針對(duì)肌纖維的細(xì)胞圖像特征分析方法，其中不僅對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲纖維進(jìn)行了特征提取，并且對(duì)提取出的特征進(jìn)行了長(zhǎng)度等特征量的定量分析和對(duì)方法準(zhǔn)確度進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析[6]。

本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的微絲纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和顯微拍照，通過形態(tài)學(xué)與閾值處理相結(jié)合的方式對(duì)指定細(xì)胞切面的微絲纖維進(jìn)行了形狀特征提取，并從形狀特征的角度選定適合的形狀特征量對(duì)微絲纖維進(jìn)行了定量分析。這些研究可望為定量表征和分析細(xì)胞的物理行為，如變形和遷移運(yùn)動(dòng)等提供新方法。

2 激光掃描共聚焦顯微鏡及大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的微絲結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2.1 激光掃描共聚焦顯微成像的原理

激光掃描共聚焦顯微成像(LSCM)[7-8]是近代最先進(jìn)的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析手段之一，已經(jīng)廣泛地運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)的研究中[9]，它除了光學(xué)顯微鏡部分外，還由激光發(fā)射器、掃描裝置、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、光檢測(cè)器以及圖像傳輸?shù)任宀糠纸M成。

與傳統(tǒng)的顯微成像方法相比，激光掃描共聚焦顯微成像通過只檢測(cè)反射自焦平面的光線部分從而防止由于焦平面上下散射光線對(duì)圖像的影響，明顯提高了圖像的分辨率和對(duì)比度，并且通過精細(xì)地平面光切，經(jīng)過計(jì)算機(jī)三維重建之后，可以從任意角度對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行三維剖面以及整體結(jié)構(gòu)的觀察分析。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料

(a)

(b)

Fig1Representativemicroscopicimagesofthemicrofilamentsinairwaysmoothmusclecellsoriginal image of cell I (a) and cell II (b)

3 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維的結(jié)構(gòu)特征分析

3.1 細(xì)胞微絲纖維結(jié)構(gòu)提取

為了能夠?qū)?xì)胞微絲結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效提取，我們利用形態(tài)學(xué)與閾值分割相結(jié)合的方式對(duì)圖1所示的細(xì)胞顯微圖像進(jìn)行處理，其流程見圖2。首先，利用33的中值濾波對(duì)圖像中存在的大顆粒椒鹽噪聲進(jìn)行有效地濾除，并利用截止頻率為10的巴特沃斯濾波器對(duì)圖像進(jìn)行銳化處理，再結(jié)合數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)，以半徑為1的圓盤矩陣對(duì)圖像進(jìn)行開運(yùn)算處理，濾除小顆粒的椒鹽噪聲，最后通過全局閾值分割提取微絲纖維結(jié)構(gòu)并將其骨骼化。

巴特沃斯高通濾波器通過控制截止頻率D0，可以獲得不同的銳化效果，n階截止頻率為D0的巴特沃斯高通濾波器的轉(zhuǎn)移函數(shù)可表示為[10]:

圖2 提取細(xì)胞微絲纖維結(jié)構(gòu)的流程圖

(1)

其中D(i,j)為點(diǎn)(i,j)到頻率平面原點(diǎn)的距離。

設(shè)B為結(jié)構(gòu)元素，集合A為待處理的圖像，利用結(jié)構(gòu)元素B對(duì)A進(jìn)行開運(yùn)算可記為:

A·B=(AΘB)?B

(2)

其中，A·B可以看成是B在A內(nèi)平移后的并集，通過B對(duì)A進(jìn)行腐蝕，再利用B對(duì)A進(jìn)行膨脹，能夠除去掉A中不能包含結(jié)構(gòu)元素B的對(duì)象區(qū)域，并且斷開狹窄的連接，去除細(xì)小的突出部分。利用上述方法處理圖2中的細(xì)胞顯微圖像，提取得到大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維結(jié)構(gòu)的結(jié)果見圖3。從中可見細(xì)胞的微絲纖維主干較好地被分割出來，并且骨骼化后的效果也較好，提高了特征分析的準(zhǔn)確性。

圖3經(jīng)過圖像處理提取得到的氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維結(jié)構(gòu)

a、b：細(xì)胞I、II的微絲纖維二值圖像，c、d：細(xì)胞I、II的微絲纖維結(jié)構(gòu)骨骼化后的骨架形態(tài)

Fig3Theintracellularstructureofmicrofilamentsofairwaysmoothmusclecellsextractedviaimageprocessing.

a, b：The binary images of cell I and II, respectively. c, d：The skeleton image of the microfilaments in cell I and II, respectively

3.2 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維形狀的特征分析

形狀特征即為物體表現(xiàn)出來的視覺特征，其具有直觀性和易理解性的特點(diǎn)。形狀特征一般可以分為兩類[11]，一類是基于邊界的特征，一類則是基于區(qū)域的特征。

(1)微絲纖維幾何特征分析

隨著城鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展，京津冀、長(zhǎng)三角和珠三角城市群的居民生活用電量逐漸上升，用電量差距越來越大。京津冀、長(zhǎng)三角和珠三角城市群的居民生活用電量及變化率見圖1。

我們采用了邊界和區(qū)域特征結(jié)合的方法描述大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維的形狀特征，包括微絲纖維數(shù)量、長(zhǎng)度、寬度3個(gè)幾何形狀因子，并以此作為描述依據(jù)，對(duì)小鼠平滑肌細(xì)胞微絲纖維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了定量分析。

微絲纖維數(shù)量N作為常見的區(qū)域形狀特征描述因子，基于標(biāo)記圖像中連通域的思想[12]，通過對(duì)提取出的細(xì)胞微絲纖維骨架進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)微絲纖維數(shù)量的統(tǒng)計(jì)。該方法不僅能夠有效地對(duì)微絲纖維進(jìn)行統(tǒng)計(jì)標(biāo)記，而且計(jì)算簡(jiǎn)單，運(yùn)算速度快。

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的時(shí)候，微絲纖維的長(zhǎng)度、寬度也會(huì)隨之發(fā)生變化。設(shè)微絲長(zhǎng)度為L(zhǎng)，微絲寬度為W。對(duì)骨骼化后的微絲纖維進(jìn)行各個(gè)連通域內(nèi)的像素?cái)?shù)Ni的統(tǒng)計(jì)，可以計(jì)算出各微絲纖維的長(zhǎng)度，即：

Li=Ni，i∈(1，N)

(3)

微絲纖維寬度可以采用微絲纖維面積Si與長(zhǎng)度Li的比值表達(dá)，即：

(4)

通過統(tǒng)計(jì)各個(gè)微絲纖維的長(zhǎng)度Li、寬度Wi，可以計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)微絲纖維的平均長(zhǎng)度和寬度。

(2)微絲纖維分布特征分析

微絲纖維的區(qū)域分布是細(xì)胞后續(xù)行為功能的重要參數(shù)，利用灰度共生矩陣分析其灰度的空間分布來描述微絲纖維的區(qū)域分布特征，選擇能量、熵、逆差距三個(gè)參數(shù)作為描述因子反映區(qū)域變化。

設(shè)f(x,y)為圖像中的一個(gè)點(diǎn),f1(x1,y1)為偏離它的一點(diǎn)，設(shè)該點(diǎn)對(duì)的灰度范圍為(g1,g2)，令f(x,y)遍歷整個(gè)圖像，則會(huì)得到一組(g1,g2)值，設(shè)其灰度值級(jí)為k，則(g1,g2)可能存在k的平方種，統(tǒng)計(jì)在各個(gè)灰度級(jí)上出現(xiàn)的次數(shù)，得出一個(gè)矩陣，并根據(jù)各級(jí)(g1,g2)出現(xiàn)的次數(shù)計(jì)算出概率p(g1,g2)，這種矩陣即為灰度共生矩陣。

設(shè)E為角度方向二階矩陣即能量，其體現(xiàn)圖像的灰度分布均勻程度和規(guī)則變化程度，E值越大則說明紋理分布不均勻，集中在某一塊，紋理呈規(guī)則性變化，E越小則表明紋理分布均勻。E可表達(dá)為[13]：

(5)

設(shè)H為熵值，其體現(xiàn)圖像紋理分布的離散程度，H越大則表明其灰度空間分布越分散，H越小則表明其灰度空間分布越集中。H可表達(dá)為[13]：

(6)

設(shè)I為逆差距，其體現(xiàn)圖像紋理的局部變化程度，I越大表明圖像紋理局部均勻，反之I越小表明圖像紋理局部不均勻。I可表達(dá)為[13]：

(7)

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 微絲纖維幾何特征實(shí)驗(yàn)分析

本次實(shí)驗(yàn)分別從兩組細(xì)胞切片組中隨機(jī)選取兩張切片圖像(見圖1 細(xì)胞I、II)，按以上所述方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)微絲纖維數(shù)量、長(zhǎng)度、寬度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖4為選定的兩個(gè)細(xì)胞切片中序號(hào)為1～32的微絲纖維的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從圖中可清晰地看出細(xì)胞內(nèi)微絲纖維的長(zhǎng)度分布。細(xì)胞I的微絲纖維長(zhǎng)度整體大于細(xì)胞II的微絲纖維長(zhǎng)度，長(zhǎng)度分布于15.53～174.87μm之間，其中最長(zhǎng)的微絲長(zhǎng)約174.87μm，貫穿整個(gè)細(xì)胞切面，其平均微絲纖維長(zhǎng)度為41.63μm；細(xì)胞II的微絲纖維長(zhǎng)度分布于6.83～92.25μm之間，其中最長(zhǎng)的微絲纖維長(zhǎng)度約92.25μm，平均微絲纖維長(zhǎng)度為26.32μm。

圖5為這兩個(gè)細(xì)胞切面圖像中微絲纖維的寬度統(tǒng)計(jì)結(jié)果?？梢娂?xì)胞I和細(xì)胞II中微絲纖維的寬度整體上相近。細(xì)胞I的微絲纖維寬度分布于0.03～0.18μm之間,平均寬度為0.08μm；細(xì)胞II的微絲纖維寬度分布于0.01～0.47μm之間，平均寬度為0.09μm。

表1為上述二個(gè)典型的細(xì)胞切片中微絲纖維的幾何形態(tài)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的特征值與樣品實(shí)際參考值(括號(hào)中為計(jì)算值與實(shí)際值之間的相對(duì)誤差)，包括微絲纖維的數(shù)量、平均長(zhǎng)度、平均寬度。從表中數(shù)據(jù)可以看出，計(jì)算值與實(shí)際參考值相近，誤差較低，能夠較為有效地對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中微絲纖維進(jìn)行數(shù)量、長(zhǎng)度等幾何特征統(tǒng)計(jì)。

表1大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中微絲纖維的幾何特征實(shí)際值與計(jì)算值

Table1Actualvaluesandstatisticalvaluesofshapeandorientationofmicrofilamentsinairwaysmoothmusclecells

樣品名稱數(shù)量平均長(zhǎng)度(μm) 平均寬度(μm)實(shí)際參考值細(xì)胞I3238.060.09細(xì)胞II3224.780.11本文計(jì)算值細(xì)胞I3241.63(9.37%)0.08(11.11%)細(xì)胞II3226.32(6.21%)0.09(18.18%)

圖4大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果
細(xì)胞I(左)和細(xì)胞II(右)的微絲纖維長(zhǎng)度分布
Fig4Thestatisticalresultsoflengthdistributionofthemicrofilaments.
The length distribution of microfilaments in cell I (left panel) and cell II (right panel)

圖5 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲寬度統(tǒng)計(jì)結(jié)果細(xì)胞I(左)和細(xì)胞II(右)的微絲纖維寬度分布Fig 5 The statistical results of microfilaments in airway smooth muscle cells.The width distribution of microfilaments in cell I (left panel) and cell II (right panel)

4.2 微絲纖維分布特征實(shí)驗(yàn)分析

利用灰度形態(tài)學(xué)對(duì)圖1中兩組細(xì)胞圖像分別作微小膨脹和微小腐蝕，仿真細(xì)胞微絲的生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化狀態(tài)，并利用灰度共生矩陣進(jìn)行分析這種變化。

圖6為兩組細(xì)胞的生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真圖像，對(duì)細(xì)胞I微絲二值圖像進(jìn)行微小膨脹，對(duì)細(xì)胞II微絲二值圖像進(jìn)行微小腐蝕。

圖6大鼠氣道平滑肌細(xì)胞微絲纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真圖像
細(xì)胞I(左)做膨脹處理和細(xì)胞II(右)做腐蝕處理

Fig6Physiological,pathologicalorstressresponsechangingsimulationimageofthemicrofilamentsinairwaysmoothmusclecells
Expansion treatment in cell I (left panel) and Corrosion treatment in cell II (right panel)

表2為兩組細(xì)胞纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真前后，灰度共生矩陣參數(shù)變化(括號(hào)中為各參數(shù)變化大小)，從表中數(shù)據(jù)可以看出在模擬細(xì)胞行為變化前后，能量和熵值會(huì)根據(jù)仿真行為的變化而出現(xiàn)較為顯著的變化，尤其是熵的相對(duì)變化分別達(dá)到了29.60%和37.11%。而逆差距則無明顯變化。在對(duì)細(xì)胞I微絲做膨脹模擬實(shí)驗(yàn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)能量明顯降低而熵值明顯增大情況，分別改變了-7.06%和+29.60%；在對(duì)細(xì)胞II微絲做收縮模擬實(shí)驗(yàn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)能量明顯增大而熵值明顯降低情況，分別改變了+7.85%和-37.11%。

表2大鼠氣道平滑肌細(xì)胞中微絲纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真前后灰度共生矩陣參數(shù)值

Table2GLCMvaluesofmicrofilamentsinairwaysmoothmusclecellswithchangesinphysiological,pathological,orstressresponse

樣品名稱仿真操作能量逆差距 熵細(xì)胞I0.8210.9840.402膨脹操作0.763(-7.06%)0.985(+1.02%)0.521(+29.60%)細(xì)胞II0.8280.9840.388腐蝕操作0.893(+7.85%)0.985(+1.02%)0.244(-37.11%)

5 結(jié)論

通過形態(tài)學(xué)結(jié)合閾值分割對(duì)大鼠氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)部微絲纖維的主干進(jìn)行有效提取，并從形狀特征的角度，以數(shù)量、長(zhǎng)度、寬度三個(gè)特征量對(duì)細(xì)胞切面進(jìn)行了形狀特征的定量分析，從分析結(jié)果可以看出，所給出的方法能夠較為精確地計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)部微絲長(zhǎng)度、寬度等幾何特征量，測(cè)量結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相近，且利用幾何形態(tài)學(xué)對(duì)圖像進(jìn)行微腐蝕和微膨脹的操作來進(jìn)行纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的變化仿真實(shí)驗(yàn)。通過灰度共生矩陣計(jì)算仿真前后變化發(fā)現(xiàn)，在模擬微絲膨脹和收縮行為時(shí)，能量和熵會(huì)發(fā)生明顯變化。形態(tài)特征作為幾何特征可以直觀描述細(xì)胞內(nèi)部微絲纖維的形態(tài)變化，且結(jié)合紋理特征能夠作為纖維生理、病理或應(yīng)力響應(yīng)的區(qū)域特征變化依據(jù)，在細(xì)胞指定切面分析這種變化，有利于研究者們從二維平面的角度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全面分析。