程賢利等

摘要：采用平板劃線法從秦巴山區(qū)虎杖根狀莖中分離內(nèi)生放線菌，依照形態(tài)學(xué)常規(guī)分類方法和16S rDNA序列分析法進(jìn)行鑒定，并以大腸埃希桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為靶標(biāo)菌，采用濾紙片擴(kuò)散法研究虎杖內(nèi)生放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性。結(jié)果表明，分離得到的16株放線菌中，菌株P(guān)EA005和PEA006分屬于擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）和小單孢菌屬（Micromonospora），對枯草芽孢桿菌的抑菌圈達(dá)到21～28 mm，對金黃色葡萄球菌的抑制圈達(dá)到13～20 mm，而對大腸桿菌和銅綠假單胞菌抑制作用不顯著。

關(guān)鍵詞：虎杖；內(nèi)生放線菌；分離；鑒定；秦巴山區(qū)；擬諾卡菌屬；小單孢菌屬

中圖分類號： S567.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0392-03

通信作者：陳文強(qiáng)，教授，主要從事微生物資源研究開發(fā)與利用。E-mail：wenqiangc@126.com?；⒄龋≒olygonum cuspidatum）為蓼科植物，主要分布在我國湖北、四川、陜西等20多個(gè)省份，其根莖味微苦、微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具活血散瘀定痛、清熱解毒利濕、化痰止咳通喘之功效[1-2]?；⒄忍崛∥镏械挠行С煞质擒晤惡洼祯惢衔铮渲?，芪類化合物包括白藜蘆醇及白藜蘆醇苷[3]。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗血栓及防治冠心病等作用[4-6]，被列為抗心血管疾病、抗癌最有前途的藥物之一。

植物內(nèi)生菌是指存活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群，主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌[7-8]，分布于植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等器官組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙中[9]。植物與內(nèi)生菌在長期協(xié)同進(jìn)化中建立起獨(dú)特的遺傳與代謝關(guān)系，由于植物與內(nèi)生菌相互間的基因交換，使得內(nèi)生菌具有產(chǎn)生某些與植物相同或相似化合物的能力。目前發(fā)現(xiàn)并具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物大多數(shù)來源于放線菌[10-11]，其種類多樣性和豐富的代謝產(chǎn)物可以產(chǎn)生重要的生理活性物質(zhì)，因此，從傳統(tǒng)藥用植物內(nèi)生放線菌的次生代謝產(chǎn)物中，篩選出具有藥用價(jià)值的活性物質(zhì)或新型化合物，對新型藥物開發(fā)及瀕危植物資源保護(hù)具有重要意義[12]。

目前，國內(nèi)外對虎杖資源的研究主要集中在虎杖內(nèi)生真菌方面[13-15]，對內(nèi)生放線菌的研究卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以秦巴山區(qū)珍稀藥用植物虎杖為材料，對其內(nèi)生放線菌進(jìn)行分離鑒定，并對內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物的抗菌活性進(jìn)行初步研究，旨在為虎杖內(nèi)生放線菌資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料虎杖采自陜西留壩縣火燒店鄉(xiāng)和陜西漢臺區(qū)黃花河景區(qū)。靶標(biāo)菌株：大腸埃希桿菌（Escherichia coli，ATCC8739）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，ATCC6633）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC9027），均由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2培養(yǎng)基改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g、KNO3 1.0 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15.0 g、H2O 1 000.0 mL，pH值為7.2～7.4；改良高氏Ⅱ號培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g、蛋白胨0.5 g、胰蛋白胨0.3 g、NaCl 0.5 g、復(fù)合維生素0.5 g、瓊脂15.0 g、H2O 1 000.0 mL，pH值為7.2～7.4；1/10 ATCC172合成培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g、可溶性淀粉2.0 g、酵母浸汁0.5 g、CaCO3 1.5 g、N-Z-Amine A 0.5 g、瓊脂15.0 g、H2O 1 000.0 mL，pH 值為7.2～7.4；酵母膏-麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（YE）：酵母粉4.0 g、麥芽汁提物6.0 g、葡萄糖4.0 g、復(fù)合維生素 3.75 mg、瓊脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH 值為7.2；液體酵母膏―麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，YE中不含瓊脂。

1.1.3主要儀器設(shè)備LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-2102C數(shù)顯式恒溫?fù)u床，上海志成有限公司；Mycycler PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；Allegra6低溫高速離心機(jī)，美國Beckman公司。

1.2方法

1.2.1樣品預(yù)處理將新鮮虎杖根表面泥沙清除，裁成合適大小，置于500 mL燒杯內(nèi)，流水沖洗2 h；2% Tween-80溶液清洗表面，無菌環(huán)境下依次用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗；加含有1% Tween-80的0.1% HgCl2溶液分別浸泡0、35、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 min；無菌水沖洗5次，用手術(shù)刀取其韌皮部，研缽中研磨至勻漿，按1 ∶50比例加入無菌水，制備成勻漿液。

1.2.2菌株分離分別在改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、改良高氏Ⅱ號培養(yǎng)基、1/10 ATCC172合成培養(yǎng)基中加入表1中的抑菌劑制成平板，吸取100 μL勻漿液，涂布，重復(fù)5次；取最后1次沖洗用的無菌水100 μL，涂布于各分離純化培養(yǎng)基平板作為空白對照，以檢測表面消毒情況。將平板倒置，28 ℃培養(yǎng)，隨時(shí)觀察平板菌落狀態(tài)；將放線菌菌落挑在酵母膏-麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，采用平板劃線法純化至單個(gè)菌落。

表1在分離培養(yǎng)基中加入的選擇性抑制劑及作用

名稱濃度（mg/L）作用重鉻酸鉀K2Cr2O775.0抑制真菌和細(xì)菌制霉菌素nystatin75.0抑制霉菌萘啶酮酸nalidixic acid20.0抑制細(xì)菌

1.2.3抑菌試驗(yàn)分別將16株內(nèi)生放線菌于28 ℃、160 r/min 發(fā)酵7 d；將發(fā)酵液12 000 r/min離心15 min，取上清，0.22 μm微孔濾膜過濾；濾液4 ℃冰箱保存，備用。挑取少量活化24 h的供試菌，在裝有10.0 mL無菌水的試管中反復(fù)搖勻，制成菌懸液；用微量取液器分別取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌菌懸液各0.2 mL注入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板表面，涂布均勻；將直徑為 8.0 mm 的無菌濾紙片在發(fā)酵液中浸泡1 h，貼到培養(yǎng)基表面，每平板貼4片，其中每2片代表1種株菌，每處理做5個(gè)平板；將平板倒置，（36±1） ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4菌株鑒定

1.2.4.1形態(tài)學(xué)鑒定觀察記錄分離菌株的菌落形態(tài)，菌絲體生長狀態(tài)及可溶性色素的產(chǎn)生情況，依據(jù)阮繼生等方法[16]進(jìn)行初步鑒定。

1.2.4.2分子生物學(xué)鑒定采用CTAB法提取菌株DNA，利用PCR引物799F和1492R對菌株16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）：2×Taq PCR Mix 12.0 μL、10.0 μmol/mL 引物各1.0 μL、D260 nm/D280 nm約等于1.80 的DNA模板2.0 μL、滅菌雙蒸水9.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、56 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，將純化的PCR產(chǎn)物交上海生工生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序；將所測序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast檢索；下載與分離菌株具有較高同源性的模式菌株數(shù)據(jù)，利用Clusta-X和Mega 5.1軟件對所得序列進(jìn)行人工校正及比對分析，按聚類分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1虎杖不同消毒時(shí)間效果比較

使用含有1% Tween-80的0.1% HgCl2溶液，分別浸泡虎杖樣品0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 min進(jìn)行表面消毒，觀察培養(yǎng)基上雜菌菌落的生長情況以考察消毒效果。結(jié)果表明，不使用HgCl2對虎杖樣品進(jìn)行表面消毒的對照組，即消毒0 min，培養(yǎng)基上的雜菌菌落很多，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；隨著HgCl2消毒時(shí)間的延長，菌落數(shù)逐漸減少，消毒3.5 min，菌落數(shù)在10個(gè)以上；消毒4.0 min，菌落數(shù)為5～10個(gè)；消毒4.5 min，菌落數(shù)少于5個(gè)；消毒時(shí)間超過5 min時(shí)，無菌落生長，但是，消毒時(shí)間過長，可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)生菌被殺死。因此，虎杖樣品表面消毒最佳時(shí)間為5 min。

2.2分離出的虎杖內(nèi)生放線菌菌株形態(tài)

本試驗(yàn)共分離純化出虎杖內(nèi)生放線菌菌株16株，圖1至圖4為部分菌株的菌落形態(tài)。由圖1至圖4、表2可見，菌株P(guān)EA005表面干燥無突起，菌落較小，邊緣規(guī)則，近似圓形，呈墨藍(lán)色，產(chǎn)生可溶性色素；菌株P(guān)EA006表面有突起，濕潤油狀，菌落較細(xì)小，不規(guī)則小圓形，呈橙黃色，不產(chǎn)生可溶性色素；菌株P(guān)EA014表面無突起，干粉狀，菌落較細(xì)小，較規(guī)則的圓形，邊緣無暈圈，呈灰白色，不產(chǎn)生可溶性色素；菌株P(guān)EA023表面有小的突起，褶皺狀，菌落較小，較規(guī)則圓形；呈褐色，產(chǎn)生的可溶性色素為醬紅色。

2.3虎杖內(nèi)生放線菌的抑菌活性

采用濾紙片法對內(nèi)生放線菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)，結(jié)果由表3可見，菌株P(guān)EA005和PEA006對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌抑菌效果顯著，而對大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌抑菌作用不顯著。

2.4抑菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

對2株具有較強(qiáng)抑菌作用的菌株P(guān)EA005、PEA006進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，利用SDS-溶菌酶法提取菌株總DNA，并使用引物799F和1492R對16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)上海生工生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，采用Mega5.5軟件，按表2虎杖內(nèi)生放線菌菌株的形態(tài)學(xué)特征

3結(jié)論與討論

相關(guān)研究表明，較容易分離得到的植物內(nèi)生菌是細(xì)菌和真菌，由于放線菌生長十分緩慢，且易被外源菌污染，許多放線菌特別是稀有放線菌未被發(fā)現(xiàn)[17-18]。選擇性分離是虎杖內(nèi)生放線菌分離的難點(diǎn)。

近年來，人們開展了大量有關(guān)植物內(nèi)生放線菌的研究，并從藥用植物虎杖中分離出許多新的放線菌?？讈喣械炔捎猛坎挤◤幕⒄冉M織中分離出47株內(nèi)生放線菌，其中17株菌株對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌具有不同程度的抗菌活性，占所有分離菌株的36.2%，其中6株具有較明顯的抑菌活性[19]。陳文強(qiáng)等對分離獲得的41株內(nèi)生放線菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有13株菌株至少對 1種靶標(biāo)菌表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中2株菌株發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢菌、大腸桿菌、沙門氏菌等4種靶標(biāo)菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，顯示了廣譜的抗菌活性，可能具有很好的生物防治潛力[20]。

本研究采用平板劃線法從秦巴山區(qū)藥用植物虎杖根莖中分離得到16株內(nèi)生放線菌，對其進(jìn)行抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株P(guān)EA005和PEA006對枯草芽孢桿菌的抑菌圈達(dá)到21～28 mm，對金黃色葡萄球菌的抑制圈達(dá)到13～20 mm，而對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用不顯著。經(jīng)鑒定，菌株P(guān)EA005和PEA006分屬于擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）和小單孢菌屬（Micromonospora）。

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