符宏磊，侯茂霞，孫紫悅，岳利芳，賈士儒，戴玉杰

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

發(fā)菜多糖對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子及抗氧化能力的影響

符宏磊，侯茂霞，孫紫悅，岳利芳，賈士儒，戴玉杰*

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

研究了野生發(fā)菜多糖（EPSA）和人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖（EPSB）對(duì)小鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）的影響并且測(cè)定了谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX），過氧化氫酶（CAT），超氧化物岐化酶（SOD），丙二醛（MDA）的活性。實(shí)驗(yàn)表明，EPSA和EPSB對(duì)血清中IL-1的含量幾乎沒影響。EPSA高劑量組（100mg/kg·d）和EPSB高劑量組（100mg/kg·d）均能提高小鼠血清中IL-6的含量，其中EPSB高劑量組與空白組比較，差異顯著（p＜0.05）。而且，不同劑量的EPSA和EPSB均極顯著的提高了血清中IL-12的含量（p＜0.01）。此外，在高劑量條件下，EPSA和EPSB與空白組相比，均能顯著性地提高血清中TNF-α含量（p＜0.05）。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（100mg/kg·d）EPSA與低劑量（50mg/kg·d）EPSB的CAT活性均極顯著的高于對(duì)照組（p＜0.01）。高劑量（100mg/kg·d）EPSA與對(duì)照組相比，可以極顯著的提高小鼠血清中的谷胱甘肽氧化物酶（GSH-PX）的含量（p＜0.01）。兩種多糖對(duì)MAD含量影響不顯著（p＞0.05）。EPSA能夠顯著（p＜0.05）提高小鼠血清中SOD的含量，此外，低劑量的EPSB能極顯著（p＜0.01）提高小鼠血清中SOD的的含量。

發(fā)狀念珠藻，多糖，細(xì)胞因子，抗氧化

發(fā)菜（發(fā)狀念珠藻，Nostoc flagelliforme），主要分布于北部和西北部的干旱、半干旱地區(qū)。野生發(fā)菜分泌大量多糖在體外形成鞘體、黏液層和莢膜，液體培養(yǎng)條件下發(fā)菜細(xì)胞可將多糖分泌到培養(yǎng)液中。研究發(fā)現(xiàn)從野生發(fā)菜中提取的酸性多糖—nostoflan，是一種潛在的抗病毒藥物［1］。同時(shí)，發(fā)菜多糖能清除多種自由基［2］，并且具有顯著的抗突變能力［3］。但是由于野生發(fā)菜資源瀕臨枯竭，使發(fā)菜及其多糖應(yīng)用受到限制。

由于野生發(fā)菜資源瀕臨枯竭，同時(shí)滿足其市場(chǎng)需求，研究者們提出了發(fā)菜的液體懸浮培養(yǎng)方法。蘇建宇等［4］從天然藻體中分離出細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，提高了發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和胞外多糖的產(chǎn)量。同時(shí)，為了對(duì)比人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖和野生發(fā)菜多糖的區(qū)別，一些學(xué)者如賈士儒等［5］研究發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖具有和野生發(fā)菜多糖相近的結(jié)構(gòu)和組成，單糖組成均為葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖；表觀分子量分別為2.79×105、2.26×105，這為研究人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖和野生發(fā)菜多糖的功能區(qū)別做了鋪墊。

免疫調(diào)節(jié)作用是多糖最重要的活性作用之一，但發(fā)菜多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究及報(bào)道不多。戴玉杰等［6］研究發(fā)現(xiàn)野生發(fā)菜多糖可以提高單核巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力并且可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖。目前，在細(xì)胞因子水平上發(fā)菜多糖如何調(diào)節(jié)免疫功能尚不完全清楚，且目前對(duì)發(fā)菜多糖體外抗氧化的研究較多，對(duì)發(fā)菜多糖體內(nèi)抗氧化的研究較少。本實(shí)驗(yàn)主要從四種免疫細(xì)胞因子的角度初步探討了發(fā)菜多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，并且通過測(cè)定GSH-PX、CAT、SOD、MDA的酶活性評(píng)價(jià)了發(fā)菜多糖的體內(nèi)抗氧化功能。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)采用BALB/c小鼠SPF級(jí)，雄性，體重為18～20g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，許可證號(hào)SCXK（京）2009-0017，飼養(yǎng)在溫度20～25℃，相對(duì)濕度50%±5%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為空白組、發(fā)菜多糖50mg/kg劑量組、發(fā)菜多糖100mg/kg劑量組；IL-1、IL-6、L-12、TNF-γ細(xì)胞因子ELISA試劑盒上海研輝生物科技有限公司；CAT檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒、GSH-PX檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒上海研輝生物科技有限公司。

150i/240i型 CO2培 養(yǎng) 箱Thermo公 司 ；SPECTRAmax 190型全自動(dòng)酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司；UEIP-503實(shí)驗(yàn)型膜過濾裝置天津膜天膜工程技術(shù)有限公司；RE3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；TD5A-WS湘儀離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)菜胞外多糖的制備

1.2.1.1野生發(fā)菜胞外多糖的提?。?］將野生發(fā)菜洗凈后，80℃熱水反復(fù)浸提4次后，浸提液使用截流分子量為10000u超濾膜濃縮。濃縮液經(jīng)離心（4000r/min，10m in）后得上清液。向上清液中加入4倍體積的無水乙醇，使乙醇含量為80%，4℃過夜，離心取得多糖沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀后將沉淀凍干后得野生發(fā)菜胞外多糖［5］，人工命名為EPSA。

1.2.1.2人工培養(yǎng)發(fā)菜胞外多糖的提取發(fā)菜細(xì)胞經(jīng)人工液體懸浮培養(yǎng)［8］20d，培養(yǎng)液使用截流分子量為10000u的超濾膜濃縮。濃縮液處理方法同上，沉淀凍干后備用，人工命名為EPSB。

然后分別將濃縮液在4000r/m in下離心10m in得上清液。向上清液中加入4倍體積的無水乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4℃過夜，使用sevag法［9］反復(fù)除蛋白7次后，將多糖冷凍干燥，最后得到發(fā)菜胞外多糖，使用苯酚-硫酸法測(cè)得其多糖含量為73%。

1.2.2細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α的測(cè)定小鼠給藥結(jié)束后摘眼球取血，于4℃冰箱放置4h，待血清析出后，以3000r/m in離心10m in，收集血清。細(xì)胞因子的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，采用SPECTRAmax 190型全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.3GSH-PX、CAT、SOD、MDA的測(cè)定小鼠給藥結(jié)束后摘眼球取血，于4℃冰箱放置4h，待血清析出后，以3000r/m in離心10m in，收集血清。血清中GSH-PX、CAT、SOD、MDA的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，采用SPECTRAmax 190型全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果均以±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1EPSA和EPSB對(duì)小鼠血清中IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α含量的影響

表1為發(fā)菜多糖對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α）濃度的影響。由表1可以看出，與空白組相比，不同劑量的發(fā)菜多糖可以不同程度地提高小鼠血清中細(xì)胞因子的含量。結(jié)果如表1所示，EPSA和高劑量組的EPSB可以略微提高血清中IL-1的含量，但沒有顯著性（p＞0.05）。由此推斷，前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和體內(nèi)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響不明顯［5］，可能與發(fā)菜多糖對(duì)血清中IL-1濃度無明顯影響有關(guān)。

IL-6由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如單核細(xì)胞在受到LPS刺激時(shí)能產(chǎn)生IL-6，在機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能最早產(chǎn)生IL-6，成纖維細(xì)胞可自發(fā)產(chǎn)生IL-6。IL-6具有多種生物活性，如刺激多種細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，EPSB和EPSA高劑量組（100mg/kg·d）均能提高IL-6的濃度，其中高劑量組的EPSB能顯著性提高小鼠血清中IL-6的含量（p＜0.05）。低劑量組的多糖對(duì)IL-6濃度幾乎無影響。

IL-12［11］主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它能提高NK細(xì)胞的殺傷活性和LAK細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。灌胃發(fā)菜多糖后，與空白組相比，不同劑量組的EPSB和EPSA均極顯著的提高了小鼠血清中IL-12的含量（p＜0.01）。此外，相同劑量的EPSB比EPSA，小鼠血清中IL-12的水平偏高，高劑量（100mg/kg·d）的EPSB與EPSA相比，IL-12的含量差異極顯著（p＜0.01）。灌胃發(fā)菜多糖后小鼠血清中IL-12含量的提高進(jìn)一步說明了多糖能夠提高單核巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的活性；而小鼠NK細(xì)胞活性的增加，可能與小鼠血清中IL-12濃度的提高有一定關(guān)系，這與之前的報(bào)道結(jié)果一致［6］。

如表1所示，兩種多糖均能有效提高小鼠血清中腫瘤壞死因子TNF-α，并存在劑量依賴性。較空白組，高劑量的EPSA和EPSB均能顯著性提高血清中TNF-α的含量（p＜0.05），并且EPSB對(duì)TNF-α的影響更大。腫瘤壞死因子TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成產(chǎn)生，它在體內(nèi)及體外都能殺死或抑制某些腫瘤細(xì)胞。在體內(nèi)腫瘤壞死因子還可以提高T細(xì)胞及其他殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，調(diào)節(jié)不同細(xì)胞的分化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞［12］和B淋巴細(xì)胞的增殖。本課題組已有研究結(jié)果表明發(fā)菜多糖在體外能抑制A549人肺癌細(xì)胞、BEL-7402人肝癌細(xì)胞、Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)［13］。灌胃發(fā)菜多糖后小鼠血清中的腫瘤壞死因子TNF-α濃度增加進(jìn)一步表明EPSA和EPSB都具有潛在的抗腫瘤的活性。

表1　發(fā)菜多糖對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響（n=6）Table 1　Effectof N.flagelliforme polysaccharides on cytokines in serum ofmice（n=6）

2.2EPSA和EPSB體內(nèi)抗氧化活性研究

CAT、GSH-PX、SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中重要的酶類［14-17］。從表2可知，EPSA和EPSB組CAT、SOD活性均高于空白組，其中，高劑量（100mg/kg·d）EPSA與低劑量（50mg/kg·d）EPSB的CAT活性均極顯著的高于空白組（p＜0.01）；低劑量（50mg/kg·d）EPSB和EPSA，相比空白組，均極顯著（p＜0.01）和顯著（p＜0.05）的提高SOD活性，從而減少超氧陰離子對(duì)機(jī)體的傷害。高劑量（100mg/kg·d）EPSA與空白組相比，極顯著提高了GSHPX活力。從表2還可以看出隨著EPSB濃度的升高，CAT、GSH-PX、SOD三種酶的活性降低。而相反，隨著EPSA濃度的升高，CAT、GSH-PX、SOD三種酶的活性升高，存在劑量依賴效應(yīng)。表2中，多糖組的MDA濃度較空白組略高，但沒表現(xiàn)出顯著性差異。綜合分析可知，在抗氧化功能方面，低劑量（50mg/kg·d）EPSB的作用明顯優(yōu)于高劑量（100mg/kg·d）EPSB，而高劑量（100mg/kg·d）EPSA的作用明顯優(yōu)于低劑量（50mg/kg·d）EPSA。

表2　發(fā)菜多糖對(duì)小鼠血清中CAT、GSH-PX、MDA、SOD的影響（n=6）Table 2　Effectof N.flaggelliforme on the concentration of CAT，GSH-PX，MDA and SOD in serum ofmice（n=6）

3　結(jié)論

白細(xì)胞介素在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。IL-12作為一種細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)腫瘤有直接對(duì)抗作用，在原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤的免疫反應(yīng)中起重要作用［18-19］。TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子，具有直接抗腫瘤作用的細(xì)胞因子。本文研究結(jié)果表明，不同劑量組的EPSB和EPSA均極顯著（p＜0.01）的提高了小鼠血清中IL-12的含量，高劑量的EPSA和EPSB均能顯著性提高血清中腫瘤壞死細(xì)胞因子TNF-α的含量（p＜0.05），這可能是發(fā)菜多糖抗腫瘤的原因之一。

陳雪峰等［20］通過自由基清除實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)菜多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖有很強(qiáng)的清除羥自由基和超氧陰離子自由基的作用。但是，由于在生命體中，有更多的生物分子比多糖更易受到攻擊，故多糖體內(nèi)抗氧化和體外抗氧化的機(jī)制可能不同。本研究以檢測(cè)CAT、GSH-PX、SOD和MDA為指標(biāo)來評(píng)價(jià)體內(nèi)抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（100mg/kg·d）EPSA與低劑量（50mg/kg·d）EPSB分別極顯著（p＜0.01）和顯著（p＜0.05）提高了CAT和SOD活性，表明發(fā)菜多糖可以通過增強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化作用。至于發(fā)菜多糖的免疫調(diào)節(jié)作用與抗氧化作用之間是否存在關(guān)聯(lián)、存在怎樣的作用機(jī)制，是今后研究的重點(diǎn)。

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Effect of extracellular polysaccharides from Nostoc flagelliforme on the levelof cytokine and antioxitation capacity ofm ice serum

FU Hong-lei，HOU Mao-Xia，SUN Zi-yue，YUE Li-fang，JIA Shi-ru，DAIYu-jie*
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

The effects of polysaccharides from liquid-cultured Nostoc flagelliforme（EPSA）and w ild Nostoc flagelliforme（EPSB）on the level of cytokine（TNF-α，IL-1，IL-6，IL-12）and the contents of GSH-PX，CAT，SOD，MDA of BALB/c Mice were investigated.Evidences indicated that the serum level of IL-6 was raised by high dose of EPSA（100mg/kg·d）and EPSB（100mg/kg·d）and the serum level of IL-6 was significantly（p＜0.05）raised by high dose of EPSB（100mg/kg·d）.Meanwhile，IL-12 was extrem ly enhanced（p＜0.01）by different concentrations of EPSA and EPSB com pared w ith the control.Morever，the level of TNF-αwas remarkab ly inc reased（p＜0.05）by high dose of EPSA（100mg/kg·d）and EPSB（100mg/kg·d）.The content of CAT was enhanced（p＜0.01）by high dose of EPSA（100mg/kg·d）or low dose of EPSB（50mg/kg·d）.The content of GSH-PX was significantly enhanced（p＜0.01）by high dose of EPSA（100mg/kg·d）.The content of MDA was slightly enhanced by EPSA and EPSB w ith no significance（p＞0.05）.Besides，the content of SOD was significantly enhanced（p＜0.05）by EPSA and extrem ly enhanced（p＜0.01）by low dose of EPSB（50mg/kg·d）.

Nostoc flagelliforme；polysaccharides；cytokine；antioxitation func tion

TS201.4

A

1002-0306（2015）06-0351-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.068

2014-07-30

符宏磊（1988-），女，碩士研究生，研究方向：生物分離工程、微藻培養(yǎng)。

戴玉杰（1965-），男，博士，教授，研究方向：生物分離工程、微藻培養(yǎng)及藥物設(shè)計(jì)與合成。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271809）。