姚凡保　付　汐　鄺倩儀　馬海生

Survivin蛋白、CDX2在結(jié)直腸癌及癌前病變中的表達(dá)和意義

姚凡保付汐鄺倩儀馬海生

目的探討Survivin蛋白、CDX2在結(jié)直腸癌及癌前病變中的表達(dá)，為結(jié)直腸癌的早期診斷、基因靶點(diǎn)治療、評(píng)估預(yù)后、判斷復(fù)發(fā)提供新的標(biāo)記物。方法收集結(jié)直腸癌、腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及正常對(duì)照組各30例，應(yīng)用免疫組化方法分別檢測(cè)各組中Survivin蛋白、CDX2的表達(dá)情況。結(jié)果Survivin蛋白表達(dá)在腺癌組、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組及正常組各組間均有明顯差異（P＜0.01）；CDX2表達(dá)在腺癌組與低級(jí)別瘤變組、正常組之間，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、正常組之間，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與正常組之間均有顯著差異（P＜0.01），而腺癌組與高級(jí)別組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。Survivin與CDX2的表達(dá)呈高度密切負(fù)相關(guān)（r＝-0.64，P＜0.01）。結(jié)論Survivin蛋白、CDX2是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)標(biāo)記物，兩者有密切相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)可為結(jié)直腸癌早期診斷、基因靶點(diǎn)治療、評(píng)估預(yù)后、判斷復(fù)發(fā)提供新的手段。

Survivin；CDX2；結(jié)直腸癌；上皮內(nèi)瘤變

結(jié)直腸癌（colorectal carcinomor，CRC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年遞增趨勢(shì)，其晚期療效不佳，發(fā)生腹腔或肝臟等處轉(zhuǎn)移則預(yù)后極差，但如及時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸早癌，予內(nèi)鏡下切除或外科治療，結(jié)果則絕然不同。結(jié)直腸癌的早診早治目前尚有一定難度［1］，因此，尋找一簡(jiǎn)便快捷早期診斷結(jié)直腸腫瘤的手段一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。有研究表明［2］，結(jié)直腸癌的組織學(xué)發(fā)生是一個(gè)緩慢演進(jìn)的過(guò)程，腸道生態(tài)改變、基因變異等多因素參與其中，可能大部分經(jīng)歷低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變-高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變-腺癌的過(guò)程。期間，多種生物分子參與其中，并促進(jìn)了細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。Survivin蛋白是目前發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等多種生物活性作用，與抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤發(fā)展相關(guān)［3］。尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2［4］（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）是一種特異性的核轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)腸道特異基因的轉(zhuǎn)錄，目前它被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)Survivin蛋白、CDX2在結(jié)直腸癌和癌前病變中的表達(dá)，探討Survivin蛋白、CDX2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及預(yù)后。

材料與方法

一、臨床資料

收集2011年12月至2013年12月佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌標(biāo)本、腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本、腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本各30例，正常結(jié)直腸黏膜活檢標(biāo)本30例作為對(duì)照組。男68例，女52例年齡19～89歲。所有標(biāo)本以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋切片，切片厚4 μm。

二、主要試劑

CDX2和Survivin一抗工作液、HRP二抗及DAB顯色試劑購(gòu)自廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司。

三、方法

采用Envision免疫組織化學(xué)二步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，CDX2使用0.01 M檸檬酸緩沖液高溫高壓修復(fù)3 min，Survivin使用EDTA緩沖液（pH 8.0）高溫高壓修復(fù)6 min。蒸餾水洗，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS洗滌3 min×3次，滴加ALDH1（稀釋濃度1：100）及Survivin一抗，以0.01 mol/L PBS液（pH 7.4）替代一抗作為陰性對(duì)照，37℃孵育60 min，PBS洗滌3 min×3次，滴加HRP二抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。

結(jié)果判斷：根據(jù)染色強(qiáng)度及顯色細(xì)胞比例對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。按切片中顯色細(xì)胞百分比及顯色深淺進(jìn)行評(píng)分：無(wú)顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按顯色細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。以上述兩項(xiàng)評(píng)分之和作為每一例的評(píng)分。

表1　CDX2和Survivin表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用t檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)、方差分析及Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

結(jié)果

Survivin陽(yáng)性染色定位于胞漿。CDX2陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核。CDX2評(píng)分在腺癌組與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組、正常組之間，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與低級(jí)別瘤變組、正常組之間，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組與正常組之間均有顯著差異（P＜0.01），腺癌組與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。Survivin評(píng)分在各組間均有高度顯著性差異（P＜0.01）。Survivin、CDX2表達(dá)與患者年齡、性別均無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）。兩者評(píng)分值經(jīng)等級(jí)資料相關(guān)分析呈高度密切負(fù)相關(guān)（r＝-0.64，P＜0.01），見(jiàn)表1、圖1。

圖1　結(jié)直腸癌免疫組化病理所見(jiàn)（均為免疫組化二步法，×200）。

討論

尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）是一種特異性的尾型同源核基因，由311個(gè)單氨基酸構(gòu)成，最先被Mlodzik從果蠅蛋白中分離而得。CDX2蛋白的DNA表達(dá)以螺旋環(huán)繚繞并和DNA的相應(yīng)區(qū)域相結(jié)合的方式調(diào)節(jié)。CDX2分布廣泛，在消化道如食管、胃、十二指腸、結(jié)腸、胰腺等上皮細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，其中十二指腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。CDX2的正常表達(dá)在腸道上皮細(xì)胞的發(fā)育和分化中發(fā)揮著極重要的調(diào)節(jié)作用，如果CDX2的表達(dá)降低或者缺失會(huì)導(dǎo)致一系列的基因調(diào)控異常，使促癌基因表達(dá)強(qiáng)于抑癌基因而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有研究顯示，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，CDX2的表達(dá)顯著降低，而其高表達(dá)有利于抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)序的浸潤(rùn)生長(zhǎng)、增殖。CDX2調(diào)控蛋白的表達(dá)從而產(chǎn)生抑癌作用的機(jī)制復(fù)雜，體內(nèi)眾多基因參與其中。Bain等［5］在HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)CDX2的高表達(dá)能促進(jìn)P21表達(dá)mRNA增強(qiáng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成，從源頭上阻斷了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。Guo等［6］還發(fā)現(xiàn)CDX2的表達(dá)能以劑量－依賴型的方式抑制β-catenin/TCF－4介導(dǎo)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑。激活此途徑可使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞的無(wú)序生長(zhǎng)、增殖。CDX2高表達(dá)可有效抑制這一激活途徑，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分化、增殖。本研究中，CDX2在腺癌組織中表達(dá)明顯低于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和正常組織，在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中表達(dá)明顯低于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其表達(dá)程度一定程度反映了正常組織-癌前病變-癌變的過(guò)程，提示CDX2可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可能是結(jié)直腸癌重要的分子標(biāo)記物之一。

Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）的一員，是IAP家族中最小一員，被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，其編碼142個(gè)氨基酸，分子量為16.5 ku，包含兩個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)：N-端含有一個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR），該BIR區(qū)域可以通過(guò)抑制Caspase-3和Caspase-7的前體或直接抑制Caspase-3和Caspase-7本身的活性來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用；C-端是由42個(gè)氨基酸的高電荷區(qū)所形成的疏水α螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)survivin與紡錘體上的中心粒微管蛋白結(jié)合。survivin蛋白廣泛表達(dá)于胚胎組織及多數(shù)惡性腫瘤組織，成熟的正常終末分化組織不表達(dá)。Survivin具有抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，其通過(guò)抑制Caspase-3和Caspase-7的活性抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)并對(duì)抗G2/M期細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞逃離凋亡觸發(fā)點(diǎn)。同時(shí)它具有促進(jìn)腫瘤血管生成作用，使它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。有研究［7-8］表明，survivin在正常結(jié)直腸黏膜中無(wú)表達(dá)或低度表達(dá)，在結(jié)直腸腺癌中高表達(dá)，而癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織，推測(cè)survivin可能為結(jié)直腸癌發(fā)生早期的一種分子生物學(xué)改變，可作為結(jié)直腸癌早期診斷的指標(biāo)，且survivin的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，survivin的表達(dá)在正常腸黏膜、腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤、腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及結(jié)直腸腺癌中遞次增高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步揭示了survivin在結(jié)直腸腺癌組織學(xué)變化中的生物作用。

綜上所述，CDX2與Survivin與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Survivin抑制腫瘤細(xì)胞凋亡致腫瘤組織生長(zhǎng)無(wú)序無(wú)度，而CDX2的缺失亦使腫瘤細(xì)胞的無(wú)序生長(zhǎng)失控，本研究結(jié)果顯示兩者呈負(fù)相關(guān)性，提示兩者在結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制中可能有內(nèi)在關(guān)聯(lián)，具體的相互影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。因此聯(lián)合檢測(cè)CDX2與Survivin有更助于判斷結(jié)直腸癌及其癌前病變的生物學(xué)行為，可作為結(jié)直腸癌早期診斷、預(yù)后或治療效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，亦有望在分子靶向治療方面提供新的途徑。

1Van Gossum A.Guidelines for eolorectal cancer screening-a puzzle of tests and strategies.ActaClin Belg，2010，65（6）：433-436.

2賈光輝，薛軍，武雪亮，等.RUNX3、Survivin在結(jié)直腸腺癌、腺瘤、正常黏膜中表達(dá)的臨床意義.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（10）：1228-1231.

3孔令建，趙晶，曲波，等.Survivin、COX-2及VEGF在大腸癌中的表達(dá)及與腫瘤微血管密度的關(guān)系.世界華人消化雜志，2009，17（10）：2048-2053

4Beck F，Chawengsaksophak K，Luckett J，et al.A study of regional gut endoderm potency by analysis of Cdx2 null mutant chimaeric mice.Dev Biol，2003.255（2）：399-406.

5Bai YQ，Miyake S，1wai T，et a1.CDX2，a homeobox transcription factor，upregnlates transcripti of the p21/WAFl，CIPL gene.Oncogene，2003，22（39）：7942-7949.

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7Altieri D C，Survivin，cancer networks and pathway-directed drug discovery.Nat Rev Cancer，2008，8（1）：61-70.

8Hsiao H L，Wang W S，Chen P M，et a1.Overexpression of thymosin beta-4 rendem SW480 colon careinoma cells more resistant to apoptosis triggered by FasL and two topoisomerase II inhibitors via downregulation Fas and upregulation Survivin expression，respectively.Careino genesis，2006，27（5）：936-944.

Expression and significance of Survivin protein，CDX2 in colorectal cancer and precancerous diseases

YAO Fan-bao，F(xiàn)U Xi，KUANG Qian-yi，MA Hai-sheng.
Foshan Sanshui District People′s Hospital of the digestive department 528100

Objective To investigate the expression of Survivin and CDX2 in colorectal cancer，and to discuss the role of biological markers in early detection of colorectal cancer，genetically targeted treatment，assessment of prognosis，diagnosis of recurrent.Methods Collecting the colorectal cancer，adenoma with highgrade intraepithelial neoplasia，adenoma with low grade intraepithelial neoplasia and normal control group with 30 cases in each group，then detecting the expression of Survivin and CDX2 with immunohistochemistry.Results The expression of Survivin protein in the cancer group，high grade intraepithelial neoplasia group，low grade intraepithelial neoplasi a group，normal group were significantly different（P＜0.01）；the expression of CDX2 in adenocarcinoma group showed significant difference with low grade neoplasia group and normal group，high grade intraepithelial neoplasia group showed significant difference with low grade intraepithelial neoplasia group and normal group，low grade intraepithelial neoplasia was significantly different with normal group（P＜0.01），while no significant difference between the adenocarcinoma group and high grade intraepithelial neoplasia group（P＞0.05）.The expression of Survivin was highly negative correlated with CDX2（r= -0.64，P＜0.01）.Conclusion Survivin protein and CDX2 are the important biological markers in the development and progression of colorectal carcinoma，there is a close relationship between them，joint detection of survivin and CDX2 could be a new method for colorectal cancer early diagnosis，gene targeting therapy，evaluation prognosisand recurrence.

Survivin；CDX2；colorectal cancer；intraepithelial neoplasia

2015-07-13）

（本文編輯：吳保平）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.003

528100佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院消化科