陳昌琳，李　誠(chéng)，付　剛，賴　利，陳茂林，肖　嵐，楊　勇，何　利，胡　濱（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

超聲波輔助酶解制備豬肩胛骨降血壓肽的工藝及酶解效果比較

陳昌琳，李誠(chéng)*，付剛，賴?yán)惷?，肖嵐，楊勇，何利，胡濱
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

采用超聲波輔助風(fēng)味蛋白酶酶解制備豬肩胛骨降血壓肽并與常規(guī)酶解（未經(jīng)超聲處理的酶解）所得酶解液做比較。以酶解液的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制率為主要指標(biāo)，考察超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲工作間隙、超聲后酶解時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，獲得的最佳超聲條件為：超聲時(shí)間25min，超聲功率717W，超聲溫度40℃，超聲工作間隙比1∶1.5（s/s），酶解時(shí)間3h，在該條件下，得到的酶解液ACE抑制率理論值為75.29%。此條件下制備出ACE抑制率為75.58%的豬肩胛骨降血壓肽，比常規(guī)酶解提高了10.27%。半數(shù)抑制濃度（IC50）值下降32.8%，酶解時(shí)間縮短1.5h。

超聲波，酶解，降血壓肽，豬肩胛骨

長(zhǎng)久以來(lái)，食源性的降血壓肽以其副作用少、來(lái)源廣泛、降血壓效果溫和且對(duì)正常血壓無(wú)影響［1］的特點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)。制備食源性降血壓肽常用的方法是酶解法［2］，但是，傳統(tǒng)的酶解法存在費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、酶利用率低、水解效率低等問(wèn)題。研究者們開始嘗試一些不同的物理方法處理底物蛋白或者酶，比如煮沸、高壓［3］、微波［4-5］、超微粉碎［6］、超聲波［7］、超聲波-微波協(xié)同法［8］等，這些方法以改變生物大分子的分子構(gòu)型及空間結(jié)構(gòu)，不同程度地提高產(chǎn)物的活性。其中超聲波處理具有廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，因此，研究使用超聲波輔助酶解具有實(shí)際意義。

我國(guó)的畜禽資源十分豐富，每年有大量的畜禽骨資源被浪費(fèi)。研究者們利用廢棄的畜禽骨做了許多研究［9］。目前已有利用豬股骨頭制備降血壓肽的報(bào)道［10-12］，不過(guò)，常規(guī)的酶解法制備降血壓肽存在豬骨中膠原蛋白利用度不高，制備的降血壓肽活性較低等缺點(diǎn)。超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械作用和熱效應(yīng)［13］，可以使底物結(jié)構(gòu)變得松散，利于酶與底物接觸，提高酶解效率，提高蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率［14］。還可使蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露、增加疏水基團(tuán)含量［15］，根據(jù)學(xué)者對(duì)降血壓肽構(gòu)效關(guān)系的研究可知，疏水基團(tuán)對(duì)ACE抑制肽活性起重要作用［16］，可使酶解產(chǎn)物ACE抑制率增加。

用超聲波直接處理骨粉制備降血壓肽還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波細(xì)胞破碎儀處理底物，在已優(yōu)化出的酶解工藝的基礎(chǔ)上［17］，以ACE抑制率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出超聲輔助酶解制備豬肩胛骨降血壓肽的最佳超聲條件，并以常規(guī)酶解制得的降血壓肽為對(duì)照，探索利用超聲波技術(shù)提高降血壓肽ACE抑制率的可能性，為豬肩胛骨降血壓肽的理論研究和進(jìn)一步的產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮豬肩胛骨購(gòu)自雅安農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；風(fēng)味蛋白酶（酶活23.43U/mg） 上海Kayon公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL） Sigma公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

PHS-3C+酸度計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司；UV-3200型紫外分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司；ULT型冷凍干燥機(jī)美國(guó)Thermo Scientific公司；D37520 Osterode型高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Thermo有限公司；QT-2型漩渦混合器上海琪特分析儀器有限公司；ULUP-IV-10T型超純水裝置西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；JY 92-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀SCIENTZ有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程將豬肩胛骨剔凈非骨骼成分，清洗，121℃蒸煮4h，烘干，粉碎制成骨粉，冷藏備用。

稱取一定量的骨粉（蛋白含量19.96%），以底物濃度5%的比例加入蒸餾水制成骨粉懸濁液，在指定的超聲條件下超聲處理指定的時(shí)間。超聲結(jié)束后，按照先前實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出的常規(guī)酶解（以風(fēng)味蛋白酶為水解酶，酶底比6900U/g，底物濃度5%，酶解pH7.0，酶解時(shí)間4.5h［17］）的條件，酶解一定時(shí)間，酶解完成后，沸水浴滅酶10min，4℃10000r/min離心10min，得到上清液，測(cè)定其ACE抑制率。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1超聲工作間隙比對(duì)酶解液ACE抑制率的影響配制底物蛋白濃度為5%的骨粉懸濁液在超聲功率630W、超聲溫度20℃、不同的超聲工作間隙比條件下超聲10min后再在最適酶解條件下酶解3h。超聲工作間隙比分別為0.5/2、1/2、1.5/2、0.5/1、0.5/1.5、1/1.5（s/s）。

1.2.2.2超聲功率對(duì)酶解液ACE抑制率的影響配制底物蛋白濃度為5%的骨粉懸濁液在超聲溫度20℃、超聲工作間隙比1.5∶2（s/s）、不同的超聲功率下超聲10min后，再在最適酶解條件下酶解3h。超聲功率分別為：450、540、630、720、810、900W。

1.2.2.3超聲時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響配制底物蛋白濃度為5%的骨粉懸濁液在超聲功率為630W、超聲溫度20℃、超聲工作間隙比1.5∶2（s/s）下超聲不同時(shí)間后再酶解3h。超聲時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30min。

1.2.2.4超聲溫度對(duì)酶解液ACE抑制率的影響配制底物蛋白濃度為5%的骨粉懸濁液在超聲功率630W、超聲工作間隙比1.5∶2（s/s）、不同的超聲溫度下超聲10min后再酶解3h。超聲溫度分別為20、30、40、50、60℃。

1.2.2.5超聲后酶解時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響配制底物蛋白濃度為5%的骨粉懸濁液在超聲功率為630W、超聲溫度20℃、超聲工作間隙比1.5∶2（s/s）下超聲10min后，分別在最適酶解條件下酶解2、2.5、3、3.5、4h。

以酶解液ACE抑制率為指標(biāo)，篩選出最適超聲條件。

1.2.3響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度為影響因素，以ACE抑制率為響應(yīng)值，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，采用Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，得出超聲輔助酶解制備降血壓肽的最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of RSM experiment

1.2.4ACE抑制率的測(cè)定在Cushman等［18］所用的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。方法如下：將酶解液稀釋5倍，將ACE酶配制成0.1U/mL溶液，將HHL溶解在0.1mol/L、pH8.3的硼酸緩沖液（含有0.3mol/L NaCl）中配制成5mmol/L的HHL溶液，在10mL試管中加入100μL 5.0mmol/L的HHL溶液和20μL樣品液，混勻后于37℃水浴中保溫5min后，加入20μL的ACE酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，混勻后于37℃水浴中保溫60min，從水浴鍋中取出，加入150μL 1mol/L的HCl終止反應(yīng)，再加入1.2mL冷凍后的乙酸乙酯，強(qiáng)烈振蕩混勻后，靜置5min，然后以4000r/min離心20min，用移液管吸取1.0mL的乙酸乙酯層（上層），在110℃烘箱中經(jīng)1h烘干，最后加入4mL的蒸餾水充分溶解后于228nm處檢測(cè)吸光值。平行對(duì)照管除在反應(yīng)前先加入150μL 1mol/L的HCl以終止反應(yīng)外，其余成分、操作步驟同反應(yīng)管。

式中，Aa是樣a的吸光度，樣a加入了樣品液，與ACE、HHL共同反應(yīng)的測(cè)定值；Ab是樣b的吸光度，樣b為反應(yīng)中未加入樣品液，反應(yīng)結(jié)束后添加樣品液以維持整個(gè)反應(yīng)體系平衡，是ACE與HHL完全反應(yīng)的參照的測(cè)定值；Ac是樣c的吸光度，樣c在反應(yīng)前先使ACE失活，再加入樣品液，是ACE與HHL反應(yīng)的空白對(duì)照的測(cè)定值。

1.2.5IC50值測(cè)定方法將酶解液稀釋成不同濃度（實(shí)驗(yàn)點(diǎn)≥5），分別測(cè)定其ACE抑制率。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制率為縱坐標(biāo)，繪制成圓滑曲線，從曲線中計(jì)算出IC50值。

1.2.6多肽得率測(cè)定在付玉海等［19］所用方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)。多肽含量測(cè)定程序：取一定量樣品等體積加入15%（W/V）的三氯乙酸（TCA），混勻，靜置10min，以沉淀大分子蛋白，然后在4000r/min離心20min，以Lowry法測(cè)定上清液蛋白含量。肽得率的計(jì)算公式如下：

式中，N1為TCA可溶性肽含量，N2為底物總蛋白含量［20］。

1.2.7水解度的測(cè)定方法計(jì)算公式如下：

式中，N2為酶解后游離氨基氮含量，采用中性甲醛滴定法［21］；N1為酶解前游離氨基氮含量；N0為總氮含量。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以方差分析ANOVA來(lái)檢測(cè)平均值之間的差異，以p＜0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析使用Design Expert、SPSS和Origin 8.1軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1超聲工作間隙比對(duì)酶解液ACE抑制率的影響

圖1表示骨粉懸濁液在不同超聲工作間隙比處理下對(duì)酶解液ACE抑制率的影響，當(dāng)工作間隙比為1∶1.5（s/s）時(shí)，酶解液ACE抑制率最高，其可能的原因是在這樣的時(shí)間配比下，底物蛋白能夠充分的被超聲波作用。

圖1　不同超聲工作間隙比對(duì)酶解液ACE抑制率的影響Flg.1　Influence of on-time and off-time of ultrasonic on inhibitory activity of the hydrolysate

2.1.2超聲功率對(duì)酶解液ACE抑制率的影響圖2表示不同超聲功率處理底物對(duì)酶解液ACE抑制率的影響。其中，在超聲功率為720W時(shí)，酶解液有最高的ACE抑制率，再繼續(xù)增大超聲功率，酶解液抑制率下降。其可能的原因是底物經(jīng)過(guò)一定程度的超聲處理后，結(jié)構(gòu)變得松散，有利于酶和蛋白質(zhì)接觸。而隨著功率的進(jìn)一步加大，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，由于超聲波對(duì)底物蛋白質(zhì)化學(xué)鍵的破壞沒有選擇性，超聲波可能將有利于酶解液ACE抑制率的肽鏈破壞，從而降低酶解液ACE抑制率。

圖2　不同超聲功率對(duì)酶解液抑制活性的影響Flg.2　Influence of ultrasonic power on inhibitory activity of the hydrolysate

2.1.3超聲時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響圖3表示不同超聲時(shí)間對(duì)酶解液的ACE抑制率的影響。超聲處理到25min后，酶解液的ACE抑制率為最高，之后隨著超聲時(shí)間增加，抑制率反而下降，這是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的超聲處理會(huì)使暴露的疏水性基團(tuán)又重新結(jié)合形成較低疏水性的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)［22］。

圖3　不同超聲時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響Flg.3　Influence of ultrasonic treatment time on inhibitory activity of the hydrolysate

2.1.4超聲溫度對(duì)酶解液ACE抑制率的影響圖4表示酶解液的ACE抑制率隨超聲溫度變化的趨勢(shì)。超聲處理溫度為40℃時(shí)，酶解液有最高抑制率，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在40℃下更容易發(fā)生變性。

圖4　不同超聲溫度對(duì)酶解液ACE抑制率的影響Flg.4　Influence of ultrasonic treatment temperature on inhibitory activity of the hydrolysate

2.1.5超聲后酶解時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響

圖5表示經(jīng)超聲波處理后的底物再進(jìn)行不同時(shí)間的酶解對(duì)酶解液ACE抑制率的影響。結(jié)果顯示，酶解3h所得到的酶解液ACE抑制率最高，時(shí)間延長(zhǎng)，底物被過(guò)度酶解，ACE抑制率下降。

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取對(duì)酶解液ACE抑制率影響較大的3個(gè)因素，即超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度為自變量，以ACE抑制率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其因素編碼表及結(jié)果見表2。

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

圖5　超聲后酶解時(shí)間對(duì)酶解液ACE抑制率的影響Flg.5　Influence of enzymolysis time after ultrasonic pretreatment on inhibitory activity of the hydrolysate

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及分析結(jié)果Table 2　Experimental design and results for response surface analysis

表3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3　Analysis of varlance for the fitted regression model

由表3可知，回歸方程失擬檢驗(yàn)p=0.0939＞0.05，差異不顯著，回歸方程F檢驗(yàn)p＜0.0001，差異極顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，模型可用。方程中AB、BC、A2、B2、C2的p＜0.01，差異極顯著?？偦貧w的相關(guān)性系數(shù)R2=0.9936，決定系數(shù)R2adj=0.9820，說(shuō)明方程的因變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該方程確定最佳超聲工藝條件。

結(jié)合表4可知，在實(shí)驗(yàn)所選3個(gè)因素中，對(duì)超聲輔助酶解得到的酶解液的ACE抑制率的影響大?。撼晻r(shí)間＞超聲功率＞超聲溫度。

通過(guò)ACE抑制率模型的二元多次回歸方程所作的響應(yīng)面曲面圖見圖6、圖7，分別表示的是超聲時(shí)間與超聲功率（AB）及超聲溫度與超聲功率（BC）交互作用對(duì)水解物ACE抑制率的影響。響應(yīng)曲面坡度較大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件較敏感，與表3結(jié)果一致。

圖6　超聲功率與超聲時(shí)間交互影響酶解液ACE抑制率的響應(yīng)曲面圖Flg.6　Response surface showing the effects of ultrasonic power and ultrasonic time on ACE inhibitory rate

由圖6可以看出，在C=0時(shí)，當(dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)，酶解液ACE抑制率隨超聲功率的加大，升高較快，當(dāng)超聲時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，ACE抑制率隨超聲功率的加大而下降，下降趨勢(shì)較進(jìn)行短時(shí)超聲時(shí)變得平緩。由圖7可知，當(dāng)A=0時(shí)，抑制率隨溫度升高先上升后下降，隨著超聲功率增大先上升后下降。

圖7　超聲功率與超聲溫度交互影響酶解液ACE抑制率的響應(yīng)曲面圖Flg.7　Response surface showing the effects of ultrasonic power and ultrasonic temperature on ACE inhibitory rate

經(jīng)軟件分析得到，ACE抑制率最大時(shí)的超聲條件是：超聲時(shí)間25min，超聲功率717W，超聲溫度40℃。在該條件下，得到的酶解液ACE抑制率理論值為75.29%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此條件下制備出豬肩胛骨降血壓肽的ACE抑制率為75.58%，接近于理論值。

2.3常規(guī)酶解和超聲波輔助酶解效果比較

將常規(guī)酶解及超聲輔助酶解制得酶解液IC50值、水解度、肽得率及酶解時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

表4　常規(guī)酶解和超聲輔助酶解效果比較Table 4　Consequent of the hydrolysates of pig scapula protein with/without ultrasonic pretreatment

由表4可知，采用超聲波輔助酶解得到的ACE抑制率較常規(guī)酶解高，酶解所用時(shí)間少，肽得率差異不顯著，說(shuō)明酶解液ACE抑制率的上升不是因?yàn)殡臐舛鹊脑黾印５玫降拿附庖核舛炔町悩O顯著（p= 0.005），在許多研究中都證明了，酶解液的水解度與ACE抑制率不呈線性關(guān)系［23］。

3　結(jié)論

超聲波輔助酶解制備豬肩胛骨降血壓肽的最佳超聲工藝是：超聲功率717W，超聲時(shí)間25min，超聲溫度40℃，超聲工作間隙比1∶1.5（s/s），再經(jīng)過(guò)3h的酶解處理可以獲得抑制率為75.58%酶解液。采用超聲波輔助酶解得到的降血壓肽的IC50值較常規(guī)酶解得到的降血壓肽IC50值低32.8%，酶解時(shí)間縮短1.5h，肽得率差異不顯著，水解度顯著降低。

超聲波對(duì)底物的作用十分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)經(jīng)過(guò)超聲預(yù)處理的豬肩胛骨粉的酶解產(chǎn)物的ACE抑制率進(jìn)行了研究，而超聲波對(duì)底物分子結(jié)構(gòu)上的作用還有待研究。

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Preparation of ACE-inhibitory peptides from pig scapula protein by enzymatic with ultrasonic pretreatment and comparison of enzymatic effect

CHEN Chang-lin，LI Cheng*，F(xiàn)U Gang，LAI Li，CHEN Mao-lin，XIAO Lan，YANG Yong，HE Li，HU Bin
（College of Food，Sichuan Agriculture University，Ya’an 625014，China）

Antihypertensive peptides were made from pig scapula protein through ultrasonic assisted flavourzyme enzymatic method and drew a parallel between them with those without ultrasonic pretreatment.The singlefactor method was used to analyze the effect of ultrasonic power，ultrasonic time，ultrasonic temperature，ontime and off-time of ultrasonic，enzymolysis time after ultrasonic on Angiotensin-converting enzyme（ACE）inhibitory activity of pig scapula protein hydrolysate.Operating parameters such as ultrasonic power，ultrasonic time and ultrasonic temperature were optimized using response surface analysis based on ACE inhibitory rate. The results indicated that the optimal ultrasonic conditions of pig scapula peptide were ultrasonic power of 717W，ultrasonic time of 25min，ultrasonic temperature of 40℃，on-time and off-time of 1∶1.5（s/s），enzymolysis time after ultrasonic of 3h.The theoretical value of ACE inhibitory activity was 75.29%，which was close to the actual value of 75.58%.It was 10.27%higher than that of the peptides without ultrasonic pretreatment.Halfinhibitory concentration（IC50）decreased by 32.8%，enzymolysis time shorten by 1.5h.

ultrasonic；enzyme；antihypertensive peptides；pig scapula

TS209

A

1002-0306（2015）02-0217-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.02.038

2014－05－26

陳昌琳（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：功能性食品。

李誠(chéng)（1964-），男，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。