張衛(wèi)霞 羅俊 潘年松

【摘要】目的 探討四種工藝從莪術(shù)中提取的揮發(fā)油對Hela細胞外LDH活性影響的差異性，并以此旁證遴選最優(yōu)工藝。方法 分別采用石油醚浸提法、超臨界CO2萃取法、壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制、水蒸氣蒸餾法提取莪術(shù)油，經(jīng)標準品比對等純度鑒定后，分別配制成濃度為10、20、40、80、160、320、640μg/ml的莪術(shù)油干預(yù)Hela細胞72h，按照LDH試劑盒說明檢測細胞外LDH水平。結(jié)果 壓榨法提取的莪術(shù)油在20·g/ml、其它三種方式提取莪術(shù)油20·g/ml作用于Hela細胞72h后的LDH值與陰性組比較呈現(xiàn)出顯著差異性，且明顯呈量效正相關(guān)。結(jié)論 四種工藝提取的莪術(shù)油均可量效正相關(guān)地激活LDH；壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制莪術(shù)油對LDH的激活作用顯示出量效敏感優(yōu)勢，提示壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制可能為最佳工藝。

【關(guān)鍵詞】：莪術(shù)油；LDH；活性；比較

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2015）03-0144-02

基金項目：貴州省社會發(fā)展項目（黔科合SY（2008）3027號）。

溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具行氣破血，消積止痛之功。用于治療瘢瘕痞塊，淤血經(jīng)閉，食積脹痛，早期宮頸癌1。目前關(guān)于溫莪術(shù)中揮發(fā)油的提取工藝有水蒸氣蒸餾提取法、CO2超臨界萃取提取法、鮮品榨汁提取法、石油醚回流提取法2-4，但較少有文獻就揮發(fā)油的各種提取工藝的藥效學進行比較，鑒于中藥的不同制備工藝所得的藥品抗腫瘤藥效也存在不同2。因此，對在不同工藝中提取的同一藥品進行藥效比較從而篩選出最佳提取工藝是有必要的。

1.材料與方法

1.1 實驗藥物 溫莪術(shù)藥材購于四川雙流縣溫郁金基地，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W校中藥學副教授張學愈鑒定為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。四種莪術(shù)油（分別由水蒸氣蒸餾提取法、超臨界CO2萃取提取法、鮮品榨汁經(jīng)水蒸氣蒸餾精制法、石油醚浸提法提取，由遵義醫(yī)藥高等?？茖W校制備，用Tween-80溶解，配成10mg/mL的貯存溶液，4℃避光保存。

1.2試劑 人宮頸癌Hela細胞株（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，細胞編號：GDC009）；RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT及胰酶（Sigma公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）。

1.3儀器 BIO-TEK ELX 800-UV全自動酶標儀（美國寶特），LC-2900型高效液相色譜儀（上海天普）。

1.4 方法

1.4.1細胞的培養(yǎng) 取人宮頸癌Hela細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，每1-2天傳代一次。

1.4.2 MTT試驗 將對數(shù)生長期的Hela細胞消化并制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為3×104/ml，按每孔180·l接種于96孔板，培養(yǎng)24h后分為空白調(diào)零組（僅加培養(yǎng)基）、陰性對照組（無血清培養(yǎng)基）、陽性對照組（5-Fu 10·g/ml）、溶酶組（加入等體積的0.5% Tween-80溶液）揮發(fā)油組（四種方式提取揮發(fā)油，均設(shè)10、20、40、80、160、320、640·g/ml七個濃度梯度組），每組設(shè)10個平行孔，每孔加入20ul的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)72h，于結(jié)束前4h小心吸去上清，加入無血清培養(yǎng)基200μl/孔，并加入20μl/孔濃度為5mg/ml的MTT，培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μl，混合器振蕩10min，使其充分溶解，置于自動酶標儀上，以490nm波長測定各孔的吸光度OD值[4]。重復(fù)實驗三次。

1.4.3 LDH活性檢測 收集上述加無血清培養(yǎng)基之前的上清液，根據(jù)南京建成LDH試劑盒說明檢測細胞外LDH水平。LDH活性（U/L）=（測定孔OD值-對照孔OD值）/（標準孔OD值-空白孔OD值）×標準濃度（0.2mmol/L）×樣品測試前稀釋倍數(shù)×1000。

1.4.5 統(tǒng)計處理 所有數(shù)據(jù)以X±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05認為有差異，P<0.01認為有顯著性差異。

2.結(jié)果與討論

四種工藝提取莪術(shù)揮發(fā)油的LDH值較陰性對照組明顯升高（P<0.05，P<0.01），其中鮮品榨汁經(jīng)水蒸氣蒸餾精制法揮發(fā)油在320ug/ml時LDH值最高（表1）。

表1 四種方式提取莪術(shù)油作用于Hela細胞72h后的LDH值（U/L） （X±s，n=10）

藥物濃度（·g/ml） 莪（石） 莪（超） 莪（壓） 莪（水） 陰性對照組0 — — — — 97.39±12.3610 145.46±9.84 101.65±8.43 187.86±11.78﹡ 125.13±12.83 20 164.66±7.51﹡ 136.85±13.36﹡ 243.13±12.36△ 150.67±15.82﹡ 40 234.12±21.32△ 162.32±18.44﹡ 296.65±19.14△ 257.25±30.77△ 80 298.15±22.77△ 207.82±15.99△ 338.39±23.89△ 277.72±23.01△ 160 398.31±17.28△ 280.58±41.92△ 437.47±25.71△ 315.97±50.00△ 320 428.13±25.09△ 319.83±18.85△ 463.10±16.76△ 370.31±22.73△ 640 395.92±40.38△ 331.71±40.38△ 422.35±27.25△ 386.51±36.54△ 與陰性對照組比較﹡P<0.05，△P<0.01

從實驗結(jié)果總體趨勢而言，壓榨法提取的莪術(shù)油在20·g/ml、其它三種方式提取莪術(shù)油20·g/ml作用于Hela細胞72h后的LDH值與陰性組比較呈現(xiàn)出顯著差異性，且明顯呈量效正相關(guān)。

僅從壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制莪術(shù)油對激活LDH 活性較優(yōu)而論，從莪術(shù)中提取揮發(fā)油以先壓榨獲得粗油再水蒸氣蒸餾濃縮提取精油工藝為佳。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中國藥典，一部[S].北京：化學工業(yè)出版社，2005

[2]鄒俊，涂銘旌，張學愈，等.不同提取工藝制備的溫莪術(shù)揮發(fā)油對Hela細胞的增殖抑制作用[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2008，39（4）：671～672.

[3]張學愈，盛勇，鄒俊，涂銘旌，潘年松，等.石油醚提取過50目和過325目篩目篩溫莪術(shù)揮發(fā)油收率比較[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（2）：292～293.

[4]肖艷，李俊東，等.MTT法體外藥敏實驗預(yù)測宮頸癌細胞藥物敏感性的初步探討[J].癌癥，2007，26（4）：386-389.