姜明國(guó)，甘光華，楊立芳，李西妮，楊桂柳，庹利，孫承航，黃玲，藍(lán)金枝

（1.廣西紅樹(shù)林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西北海536000；2.廣西民族大學(xué)廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530008；3.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530008；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050）

廣西紅樹(shù)林根際土壤放線菌的原位培養(yǎng)分離及其活性篩選

姜明國(guó)1，2，甘光華1，2，楊立芳3*，李西妮2，楊桂柳2，庹利4，孫承航4，黃玲3，藍(lán)金枝3

（1.廣西紅樹(shù)林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西北海536000；2.廣西民族大學(xué)廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530008；3.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530008；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050）

為了發(fā)掘廣西紅樹(shù)林根際土壤的放線菌資源，本文利用原位培養(yǎng)裝置，埋于根際土壤中俘獲放線菌，30 d后取回實(shí)驗(yàn)室，采用平板涂布法對(duì)4個(gè)地點(diǎn)的原位培養(yǎng)樣品于15種培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化；對(duì)分離株基于16S rR N A基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；進(jìn)一步進(jìn)行抗菌活性和產(chǎn)酶活性檢測(cè)。共分離得到113株放線菌。對(duì)其中33株放線菌進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明20株屬于鏈霉菌屬，11株屬于擬諾卡氏菌屬，1株屬于倫茲氏菌屬，1株與擬諾卡氏菌屬相似性最高為90%，很可能屬于放線菌一個(gè)新屬。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其中有7株、4株、18株、6株、10株、3株實(shí)驗(yàn)菌株分別對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、乙型溶血性鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用；有55株、62株、24株、72株的實(shí)驗(yàn)菌株分別具有纖維素酶活性、淀粉酶活性、膠原蛋白酶活性、酯酶活性。原位培養(yǎng)可以豐富對(duì)廣西紅樹(shù)林根際土壤的認(rèn)識(shí)，分離到了新種甚至可能是新屬的放線菌，分離得到的部分放線菌菌株具有較高生物活性，為后續(xù)工作提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

原位培養(yǎng)；紅樹(shù)林；根際土壤；放線菌；生物活性

姜明國(guó)，甘光華，楊立芳，等.廣西紅樹(shù)林根際土壤放線菌的原位培養(yǎng)分離及其活性篩選［J］.海洋學(xué)報(bào)，2015，37（2）：55—64，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.02.006

Jiang Mingguo，Gan Guanghua，Yang Lifang，et al.In situisolation of actinomycetes and screening bioactive potential from mangrove rhizosphere soi ls in Guangxi［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（2）：55—64，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.02.006

1　引言

分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落稱之為紅樹(shù)林，是海洋向陸地的過(guò)渡帶。紅樹(shù)林是至今世界上少數(shù)幾個(gè)物種最多樣化的生態(tài)系之一，有著不同于陸地的性質(zhì)：水分高、鹽分高以及氧氣缺乏，其地下部分的微生物較之其他生態(tài)系統(tǒng)有很大的差異，這就賦予了紅樹(shù)林土壤微生物產(chǎn)生活性物質(zhì)的潛在可能性［1］。廣西紅樹(shù)林面積占全國(guó)紅樹(shù)林面積的三分之一，蘊(yùn)藏著巨大的海洋微生物資源。

目前，科研工作者能在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出來(lái)的微生物，只占到微生物總體的0.1%～1%，絕大部分的微生物不能通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法獲得［2］。模擬自然環(huán)境和保持微生物間的共生關(guān)系是提高微生物培養(yǎng)具備共性的關(guān)鍵問(wèn)題，目前開(kāi)發(fā)新的策略培養(yǎng)傳統(tǒng)“不可培養(yǎng)”微生物的需求十分迫切。探索更加有效的分離方法，從海洋等極端環(huán)境中分離篩選活性菌株已成為當(dāng)前微生物資源開(kāi)發(fā)利用的重要研究方向［2—3］。原位培養(yǎng)即構(gòu)建模擬微生物生存的環(huán)境系統(tǒng)。目前可以使用“擴(kuò)散室”和“載體”兩種類型的原位培養(yǎng)模式［4—5］。A oi等設(shè)計(jì)了一種中空纖維膜室培養(yǎng)裝置，能同時(shí)用于多個(gè)簡(jiǎn)單樣品的純培養(yǎng)［6］。Gavrish等采用這種擴(kuò)散室裝置成功的對(duì)特殊和稀有放線菌進(jìn)行了培養(yǎng)分離［7］。Lewis和Nichols等采用高通量的“擴(kuò)散室”培養(yǎng)以前未能培養(yǎng)的微生物，發(fā)現(xiàn)的新種遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于用傳統(tǒng)培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)［8—9］。可見(jiàn)原位培養(yǎng)方法在微生物的研究領(lǐng)域具有巨大的潛力。

目前關(guān)于紅樹(shù)林根際土壤放線菌的分離培養(yǎng)大多采用傳統(tǒng)的分離方法，采用原位培養(yǎng)法進(jìn)行放線菌分離培養(yǎng)未見(jiàn)報(bào)道。我們利用放線菌產(chǎn)生菌絲的特點(diǎn)制作放線菌原位俘獲裝置，置于不同品系的紅樹(shù)林根際土壤中進(jìn)行共培養(yǎng)，旨在培養(yǎng)出傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法不能分離培養(yǎng)的紅樹(shù)林根際土壤放線菌。并對(duì)所分離到的放線菌進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)，為后續(xù)海洋放線菌次生代謝產(chǎn)物的研究奠定基礎(chǔ)。

2　材料和方法

2.1材料

2.1.1實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

廣西山口紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)、北海紅樹(shù)林育種中心、廣西合浦老鼠簕紅樹(shù)林和東興北侖河口紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)。

表1　廣西紅樹(shù)林原位培養(yǎng)放線菌埋樣地點(diǎn)Tab.1 Description ofin situcultivation sites

2.1.2培養(yǎng)基：

原位培養(yǎng)基：瓊脂粉30%，海水1 L，自然p H值。

分離培養(yǎng)基：配制以下15種培養(yǎng)基，海水定容至1 L，自然p H值用于菌株分離。

A.酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基（Y E M E）：酵母粉4 g，麥芽浸出粉10 g，葡萄糖4 g，瓊脂18 g；

B.改良E merson培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，蛋白胨4 g，氯化鈉2.5 g，瓊脂18 g；

C.2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸高鐵0.1 g，瓊脂18 g；

D.M 1培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，酵母粉4 g，蛋白胨2 g，瓊脂18 g；

E.ISP2培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，酵母粉4 g，麥芽浸出粉10 g，碳酸鈣2 g，瓊脂18 g；

E.酪蛋白-酵母浸汁培養(yǎng)基：酪蛋白7.5 g，酵母浸汁10 g，七水硫酸鎂2 g，檸檬酸鈉3 g，氯化鉀2 g，氯化鈉2 g，瓊脂18 g；

G.H V G培養(yǎng)基：腐植酸1 g，磷酸氫二鈉0.5 g，七水硫酸鎂0.05 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，碳酸鈣0.02 g，維生素B母液1 ml，瓊脂18 g；

H.SC培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，酪蛋白1 g，瓊脂18 g；

I.葡萄糖-天門冬素瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，天門冬素0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂18 g；

G.無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，硝酸鉀1 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂18 g；

K.改良ISP5培養(yǎng)基：酵母膏5 g，L-門冬酰胺1 g，甘油10 g，磷酸氫二鉀1 g，硝酸鉀5 g，微量鹽1 m L，瓊脂18 g；

L.甘油瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母膏3 g，甘油20 g，瓊脂18 g；

M.G Y ESA培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母膏10 g，可溶性淀粉10 g，氯化鈉5 g，碳酸鈣3 g，瓊脂18 g；

N.高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂18 g；

O.察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，七水硫酸鎂0.5 g，蔗糖30 g，瓊脂18 g；

純化培養(yǎng)基：ISP2培養(yǎng)基：葡萄糖4 g，酵母粉4 g，麥芽浸出粉10 g，碳酸鈣2 g，瓊脂18 g，海水加至1 L，自然p H值。

以上所有培養(yǎng)基在冷卻至55°C左右時(shí)加入終濃度為100μg/m L的重鉻酸鉀作為細(xì)菌和真菌的抑制劑。

生物活性檢測(cè)培養(yǎng)基：

（1）淀粉水解培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，磷酸氫二鉀0.3 g，氯化鈉0.5 g，七水硫酸鎂1 g，硝酸鉀1 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，p H 7.2～7.4。

（2）明膠培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，明膠200 g，蒸餾水1 000 m L，p H 7.2～7.4。

（3）酯酶活性篩選培養(yǎng)基：吐溫-80為10 g，硝酸銨1 g，氯化鈣0.1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鐵0.02 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1.0 g，蒸餾水1 L，p H 7.0～7.2。

（4）纖維素酶活性篩選培養(yǎng)基：微晶纖維素8 g，硝酸銨1 g，氯化鈣0.1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鐵0.02 g，磷酸二氫鉀0.5 g，酵母粉0.05 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1 g，蒸餾水1 L，p H 7.0～7.2。

2.1.3指示菌株

大腸埃希氏桿菌（E.coliC M CC 44102）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosaC M CC 10104）、金黃色葡萄球菌（S.aureusC M CC 26003）、普通變形桿菌（P.vulgarisC M CC 49027）、乙型溶血性鏈球菌（β-StreptococcusAT CC 21059）和肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae C M CC 46117）。以上6株指示菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2.1.4主要試劑

P G E M-T Easy Vector（Promega），瓊脂粉，葡萄糖，酵母粉，麥芽浸出粉，可溶性淀粉，瓊脂糖，異丙醇，乙醇，胰蛋白胨等，試劑均為分析純。

2.1.5儀器

L D Z X-50 K BS立式壓力蒸汽滅菌器，H PS-250生化培養(yǎng)箱，L E G E N DM IC R017離心機(jī)，格蘭特X B70制冰機(jī)，H R-7803D微波爐，H H-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，JY-600電泳儀，BIO-R A D凝膠成像分析儀，BIO-R A D PC R儀，Supra 55 Sapphire型掃描電子顯微鏡等。

2.2放線菌分離與純化

2.2.1原位培養(yǎng)裝置的制作

將已滅菌的0.22μm的親水性下濾膜（購(gòu)自Mi ll ipore中國(guó)有限公司）用502膠水與已滅菌的不銹鋼圈貼好，向中空內(nèi)環(huán)倒入約3 m L原位培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將親水性上濾膜和不銹鋼圈用膠水密封（圖1）。

2.2.2埋原位培養(yǎng)裝置

將原位培養(yǎng)裝置埋于紅樹(shù)林根際附近土壤中，深度為5～10 cm，每個(gè)地點(diǎn)都埋50個(gè)原位培養(yǎng)裝置。整個(gè)埋樣過(guò)程及取樣后處理如圖2所示。

2.2.3放線菌的分離純化

30 d后將原位培養(yǎng)裝置取回清潔后，將原位培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5 m L的E P管中，加入無(wú)菌水，將原位培養(yǎng)基搗碎并充分與無(wú)菌水混勻，吸取混懸菌液100μL涂布于15種分離培養(yǎng)基上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～15 d。將形態(tài)較典型的放線菌菌落挑出，經(jīng)過(guò)3～5次平板劃線分離純化后轉(zhuǎn)種到ISP2斜面培養(yǎng)基中保存，編號(hào)后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1　放線菌原位俘獲裝置Eig.1 Actinobacteriain situcultivation trap

圖2　原位培養(yǎng)裝置的使用：埋樣前（a）、取樣中（b）、清理后（c）Eig.2 Appl ication of thein situcultivation chambers：general view of the chambers（a），the chambers in use（b），after the clean-up（c）

2.3放線菌16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用微波熱震蕩［10］提取放線菌基因組D N A，16S rR N A基因序列的PCR擴(kuò)增，使用以下兩個(gè)通用引物：27E：5′-A G A G T T T G AT CC T G G C T C A G-3′，1492R：5′-A A G G A G G T G AT CC A G CC G C A-3′（由上海捷瑞公司合成），PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）：引物（10μmol/L）各0.5μL，模板D N A（50～100 ng）1μL，2×PCR Master Mix 12.5μL，加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。PC R反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，進(jìn)行切膠純化，用T載體置于4℃冰箱過(guò)夜連接，將菌株的16S rR N A轉(zhuǎn)化到E.coli（T OP10E′），經(jīng)氨芐篩選陽(yáng)性克隆，隨機(jī)挑取陽(yáng)性克隆子于37℃在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基搖床220 r/min，37°C培養(yǎng)15 h。用T7引物：5′-TA ATA C G A C T C A C TATA G G G-3′，SP6引物：5′-AT T TA G G T G A C A C TATA G-3′）進(jìn)行PC R，電泳檢測(cè)有目的條帶的菌液送到生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序得到的基因序列運(yùn)用BL AST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性分析。利用M E G A5軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

2.4菌株生物活性檢測(cè)

2.4.1菌株抑菌活性檢測(cè)

選用以上6株指示菌株進(jìn)行放線菌抗菌活性試驗(yàn)。所有細(xì)菌指示菌株都用ISP2培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用點(diǎn)植法培養(yǎng)7 d后，觀察抑菌圈并測(cè)量抑菌圈的直徑。

2.4.2菌株酶活檢測(cè)

采用用點(diǎn)植法培養(yǎng)7 d后，通過(guò)Lugol碘液檢測(cè)淀粉酶活性，通過(guò)觀察透明圈檢測(cè)膠原蛋白酶和脂肪酶活性，通過(guò)觀察菌落四周澄清的暈環(huán)檢測(cè)纖維素酶活性。

3　結(jié)果和分析

3.1原位培養(yǎng)裝置俘獲放線菌的效果

取回原位培養(yǎng)裝置后，將原位培養(yǎng)基取出，置于倒置顯微鏡中觀察，可以看到許多具有分枝狀菌絲的菌落分散在原位培養(yǎng)基內(nèi)。根據(jù)菌落的形態(tài)初步判斷原位培養(yǎng)基內(nèi)的菌落為放線菌。將原位培養(yǎng)基菌懸液涂布后，可得到較多的放線菌菌落，并且無(wú)細(xì)菌和真菌的出現(xiàn)（圖3）。表明所采用的原位培養(yǎng)裝置能較為單一地俘獲放線菌并且效果良好。值得注意的是，有部分原位培養(yǎng)裝置的濾膜遭蟲(chóng)蝕而破損、膠水粘得不牢固導(dǎo)致脫落損壞或取樣的時(shí)候被不小心戳破造成了一定的污染，這是值得改進(jìn)的地方。

圖3　原位培養(yǎng)基菌懸液涂布分離放線菌的效果Eig.3 Isolation plates of actinomycetes，which were spread within situcultivation medium suspensions and incubated at 28°C for 6 to 15 d

3.2放線菌分離結(jié)果

采用原位培養(yǎng)方法從廣西山口紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)、北海紅樹(shù)林育種中心、廣西合浦老鼠簕紅樹(shù)林和東興北侖河口紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)分別得到22株、20株、70株和1株，總共獲得113株放線菌。放線菌菌落大多氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落致密干燥，菌落顏色多為白色，其次為灰色，有少數(shù)菌株菌落為紅色或嫩黃色。其中分離到的放線菌G X U N10可能是放線菌新菌株（圖4）。

圖4　放線菌G X U N10的菌落形態(tài)（a）及其電鏡圖（b）Eig.4 Colony morphology（a）and electron micrograph（b）ofisolate G X U N10

3.3不同培養(yǎng)基分離放線菌的效果

圖5是不同培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量的比較，培養(yǎng)基種類標(biāo)號(hào)來(lái)源于分離培養(yǎng)基的編號(hào)。結(jié)果表明，ISP2培養(yǎng)基分離得到的紅樹(shù)林根際土壤放線菌菌株數(shù)量最多，其次是M 1培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基，H V G培養(yǎng)基、改良ISP5培養(yǎng)基和甘油瓊脂培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量最少。由于不是唯一碳源培養(yǎng)基，所以不能確定哪種碳源對(duì)分離放線菌最有優(yōu)勢(shì)，但也可以看出，所選用的15種分離培養(yǎng)基中ISP2培養(yǎng)基、M 1培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基最適合用來(lái)分離紅樹(shù)林根際土壤放線菌。

3.4廣西紅樹(shù)林根際土壤放線菌的多樣性

用上述15種分離培養(yǎng)基從廣西4個(gè)地方的紅樹(shù)林原位培養(yǎng)樣品中分離并保藏放線菌113株，測(cè)序了33株。測(cè)得33株放線菌菌株的16S rR N A基因序列全長(zhǎng)接近1 490 bp。用BL AST軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相似序列，然后采用鄰接法構(gòu)建放線菌與其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果（見(jiàn)圖6）顯示，33株放線菌分布于放線菌亞綱3個(gè)目3個(gè)科的4個(gè)屬。鏈霉菌目Streptomycineae中的鏈霉菌科Streptomycetaceae中的鏈霉菌屬Streptomyces20株；鏈孢囊菌目Streptosporangineae擬諾卡氏菌科Nocardiopsaceae中擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis11株；假諾卡氏菌目Pseudonocardineae中的假諾卡氏菌科Actinosynnemataceae中的倫茲氏菌屬Lentzea1株；另外一株編號(hào)為G X U N10的放線菌在基于16S rR N A基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上獨(dú)立劃分為一個(gè)分支，與鏈孢囊菌目中NocardiopsisalbaPC M 2702的序列相似性最高，但相似性僅為90%，所以G X U N10很可能為鏈孢囊菌目Streptosporangineae中的新科或新屬［11］。該菌的多相分類學(xué)研究工作正在進(jìn)行中。

圖5　不同培養(yǎng)基分離到的紅樹(shù)林根際土壤放線菌菌落數(shù)對(duì)比Eig.5 Isolate numbers of marine actinobacteria on different media

圖6　鄰接法構(gòu)建基于16S rR N A基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Eig.6 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16SrR N A gene sequences of the isolated strains

3.5生物活性檢測(cè)結(jié)果

3.5.1菌株抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)113株紅樹(shù)根際土壤放線菌進(jìn)行了抗細(xì)菌活性的初步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)47株放線菌樣品在一種或多種指示菌篩選中顯示為陽(yáng)性（表2），初篩陽(yáng)性率為41.59%。有6.19%、3.54%、15.93%、5.31%、8.85%、2.65%的實(shí)驗(yàn)菌株分別對(duì)大腸埃希氏桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、乙型溶血性鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用。其中，源于廣西山口紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)（Shankou）的22株菌中，初篩陽(yáng)性菌株為5株，陽(yáng)性率為22.73%；源于北海紅樹(shù)林育種中心（Yuzhong）的20株菌中，初篩陽(yáng)性菌株為11株，陽(yáng)性率為55.00%；源于廣西合浦老鼠簕紅樹(shù)林（Hepu）的70株菌中，初篩陽(yáng)性菌株為31株，陽(yáng)性率為44.29%；源于東興北侖河口紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)（Dongxing）的1株菌中，初篩無(wú)陽(yáng)性菌株。在47株陽(yáng)性菌株中，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌具有抑菌作用的有27株，占陽(yáng)性菌株的57.45%，占總菌株的23.89%；對(duì)所試驗(yàn)的4種革蘭氏陰性細(xì)菌具有抑菌作用的有20株，占陽(yáng)性菌株的42.55%，占總菌株的17.70%。

表2　菌株的抑菌活性篩選結(jié)果Tab.2 Antimicrobial activity of actinomycetes form Guangxi mangrove rhizosphere

3.5.2菌株酶活檢測(cè)結(jié)果

產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表3），在所檢測(cè)的113株紅樹(shù)林根際土壤放線菌，有87株至少具有一種酶活，其中具有纖維素酶活性、淀粉酶活性、膠原蛋白酶活性、酯酶活性菌株分別為48.67%、54.87%、21.24%、 63.71%。另外，有70株具有至少2種以上酶活特性，占活性菌株的80.46%，占總菌株的61.95%；有46株具有3種以上酶活特性，占活性菌株的52.87%，占總菌株的40.71%；有8株具有4種酶活特性，占活性菌株的9.20%，占總菌株的7.08%。

表3　菌株的產(chǎn)酶活性篩選結(jié)果Tab.3 Enzyme activity of actinomycetes form Guangxi mangrove rhizosphere

4　討論

國(guó)內(nèi)一些研究小組對(duì)廣西北部灣海域紅樹(shù)林共生和附生的放線菌開(kāi)展過(guò)研究，如中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所H ong等采集廣西26份紅樹(shù)林樣本，分離到了93株放線菌［12］。同樣是該研究小組2007年從廣西的紅樹(shù)林區(qū)采集了71個(gè)樣品，不進(jìn)行微生物分離而直接發(fā)酵，取發(fā)酵上清液進(jìn)行抗細(xì)菌、抗真菌與腫瘤細(xì)胞毒活性的測(cè)定，結(jié)果顯示：29.6%的樣品具有生物活性，僅次于取自?？诘臉悠罚?4.1%），在所有來(lái)自全國(guó)各地的樣品中僅在廣西北海古城嶺的樣品中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒活性［13］。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所魏玉珍等從廣西山口國(guó)家紅樹(shù)林生態(tài)自然保護(hù)區(qū)采集8種真紅樹(shù)植物和5種半紅樹(shù)植物，采用8種分離培養(yǎng)基，分離到118株放線菌。對(duì)77株陽(yáng)性菌株分類表明44株屬于鏈霉菌屬，25株為小單孢屬的菌株，3株屬于糖絲菌屬，3株為諾卡氏屬菌株，1株是擬諾卡氏屬菌株，1株是倫茨氏菌屬的菌株［14］。廣西大學(xué)梁靜娟等和桂林醫(yī)學(xué)院駱耐香等也對(duì)紅樹(shù)林放線菌開(kāi)展了部分研究［15—16］。這些研究結(jié)果表明廣西紅樹(shù)植物環(huán)境孕育了豐富多樣的放線菌，但從分離方法上看，并沒(méi)有全面系統(tǒng)地反映廣西北部灣海域海洋放線菌即便是紅樹(shù)林共生和附生的放線菌真實(shí)面目。

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法為了盡量殺滅細(xì)菌和真菌、使土壤放線菌孢子盡量分散，大多采用強(qiáng)化學(xué)試劑、強(qiáng)物理震蕩或高溫干熱處理，如超聲波處理法［17］、干熱處理法［18］、D DC法［19］和微波處理法［20］等，尚無(wú)采用原位培養(yǎng)法［21］進(jìn)行放線菌分離培養(yǎng)的報(bào)道。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)紅樹(shù)林土壤放線菌的方法大多比較激烈，并且使土壤放線菌離開(kāi)它們?cè)旧畹沫h(huán)境，放線菌的環(huán)境生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)成分勢(shì)必也隨之改變，可能對(duì)部分對(duì)環(huán)境要求苛刻的放線菌造成巨大傷害，從而不能分離培養(yǎng)這部分放線菌。而原位培養(yǎng)法能盡量在不改變微生物的生長(zhǎng)環(huán)境和條件的情況下，將原位培養(yǎng)裝置置于紅樹(shù)林根際土壤中，讓放線菌菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入原位培養(yǎng)裝置中，從而將放線菌俘獲。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步用多種不同的培養(yǎng)基將俘獲的放線菌分離、多次純化從而得到純培養(yǎng)的放線菌。原位培養(yǎng)法是在放線菌生長(zhǎng)的大環(huán)境中與放線菌共培養(yǎng)，溫和而不刺激，為分離新放線菌提供了可能。

本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的原位培養(yǎng)裝置是在Lewis等［8］的設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的，Lewis K設(shè)計(jì)的原位培養(yǎng)裝置是為了在實(shí)驗(yàn)室將原位培養(yǎng)裝置置于土壤樣品表面，俘獲透過(guò)下濾膜進(jìn)入原位培養(yǎng)裝置的土壤放線菌。為了隔絕空氣中的菌體透過(guò)濾膜進(jìn)入到原位培養(yǎng)裝置中上濾膜選擇0.03μm孔徑，選擇孔徑為0.2μm的下濾膜緊貼土壤表面，土壤中的放線菌菌絲可以透過(guò)下濾膜進(jìn)入到原位培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。為了俘獲土壤中的放線菌，我們?cè)O(shè)計(jì)了可以在真實(shí)環(huán)境埋入泥土中俘獲土壤放線菌的原位培養(yǎng)裝置：上下濾膜都選用孔徑0.22μm的濾膜。這樣原位培養(yǎng)裝置上面及下面的放線菌菌絲都能進(jìn)入原位培養(yǎng)裝置中，從而被俘獲。本研究成功俘獲分離113株放線菌，選取33株典型的放線菌提取其基因組D N A，擴(kuò)增其16S rR N A基因，克隆后成功測(cè)序。33株放線菌中的32株隸屬于3個(gè)不同菌屬，其中鏈霉菌屬最多，占62.5%；擬諾卡氏菌屬占34.375%；倫茲氏菌屬占3.125%。得到一株G X U N10很可能隸屬于放線菌一個(gè)新分類單元。這表明原位培養(yǎng)裝置埋于紅樹(shù)林根際土壤放線菌原本生活的環(huán)境俘獲放線菌的可行性，為國(guó)內(nèi)放線菌研究者尋找新的放線菌資源提供了新的參考途徑。并且我們用原位培養(yǎng)法所分離到的放線菌具有較好的抑菌活性和酶活活性，為后續(xù)放線菌次生代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］徐麗華，李文均，劉志恒，等.放線菌系統(tǒng)學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2007：19.

Xu Lihua，Li W enjun，Liu Zhiheng，et al.Systematics of Actinobacteria［M］.Bei j ing：Science Press，2007：19.

［2］Alain K，Querel lou J.Cultivating the uncultured：l imits，advances and future chal lenges［J］.Extremophi les，2009，13（4）：583-594.

［3］Eerrari B C，Binnerup S J，Gi ll ings M.Microcolony cultivation on a soi l substrate membrane system selects for previously uncultured soi l bacteria［J］.Appl Environ Microbiol，2005，71（12）：8714-8720.

［4］Yasumoto-Hirose M，Nishi j ima M，Ngirchechol M K，et al.Isolation of marine bacteria byinsituculture on media-supplemented polyurethanefoam［J］.Mar Biotechnol，2006，8（3）：227-237.

［5］Bol lmann A，Lewis K，Epstein S S.Incubation of environ mentalsamplesin a diffusion chamberincreasesthe diversity ofrecoveredisolates［J］.Appl Environ Microbiol，2007，73（20）：6386-6390.

［6］Aoi Y，Kinoshita T，Hata T，et al.H ollow-fiber membrane chamber as a device forin situenviron mental cultivation［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75（11）：3826-3833.

［7］Gavrish E，Bol lmann A，Epstein S，et al.A trap for in situ cultivation of fi lamentous actinobacteria［J］.J Microbiol M ethods，2008，72（3）：257-262.

［8］Lewis K，Epstein S，D'Onofrio A，et al.U ncultured microorganisms as a source of secondary metabol ites［J］.The Journal of Antibiotics，2010，63：468-476.

［9］Nichols D，Cahoon N，Trakhtenberg E M，et al.Use ofIchip for high-throughputin situ cultivation of“uncultivable”microbialspecies［J］.Appl En-viron Microbiol，2010，76（8）：2445-2450.

［10］徐平，李文均，徐麗華，等.微波法快速提取放線菌基因組D N A［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2003，30（4）：82-84.

Xu Ping，Li W enjun，Xu Lihua，et al.A microwave-based method for genomic D N A extraction from actinomycetes［J］.Microbiology China，2003，30（4）：82-84.

［11］Stackebrandt E，Goebel B M.Taxonomic Note：A placefor D N A-D N A reassociation and 16S rR N A sequence analysisin the present species definition in bacteriology［J］.Int J Syst Bacteriol，1994，44（4）：846-849.

［12］Hong K，Gao A H，Xie Q Y，et al.Actinomycetes for marine drug discovery isolated from mangrove soi ls and plantsin China［J］.Marine Drugs，2009，7（1）：24-44.

［13］劉穎，洪葵，莊令，等.紅樹(shù)林樣品不經(jīng)分離的微生物群體培養(yǎng)物生物活性研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2007，47（1）：110-114.

Liu Ying，Hong Kui，Zhuang Ling，et al.Bioactivity survey of natural microbial consortiu m from mangrove［J］.Acta Microbiologica Sinica，2007，47（1）：110-114.

［14］魏玉珍，張玉琴，趙莉莉，等.廣西山口紅樹(shù)林內(nèi)生放線菌的分離、篩選及初步鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010（6）：823-828.

W ei Yuzhen，Zhang Yuqin，Zhao Li l i，et al.Isolation，screening and prel iminary identification of endophytic actinobacteria from mangroves at Shankou of Guangxi province［J］.Microbiology China，2010（6）：823-828.

［15］梁靜娟，龐宗文，詹萍.紅樹(shù)林海洋細(xì)菌的分離鑒定及其活性物質(zhì)初步分析［J］.熱帶海洋學(xué)報(bào)，2006，25（6）：47-51.

Liang Jingjuan，Pang Zongwen，Zhan Ping.Isolation and identification of mangrove marine bacteria and analysis of their bioactive products［J］. Journal of Tropical Oceanography，2006，25（6）：47-51.

［16］駱耐香，陳森洲，袁桂峰，等.廣西沿海地區(qū)紅樹(shù)林根系土壤中放線菌的分離與鑒定［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（2）：310-313.

Luo Naixiang，Chen Senzhou，Yuan Guifeng，et al.Isolation and identification of actinobacteria from the soi l ofroot system of mangrove forestin Guangxi coastal area［J］.Genomics and Appl ied Biology，2010，29（2）：310-313.

［17］姜怡，曹艷茹，趙立興，等.超聲波處理土樣分離放線菌［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50（8）：1094-1097.

Jiang Yi，Cao Yanru，Zhao Lixing，et al.Ultrasonictreatment of soi lsamplesfor actinomyceteisolation［J］.Acta Microbiologica Sinica，2010，50（8）：1094-1097.

［18］曹艷茹，姜怡，李有龍，等.孟加拉虎糞便放線菌的分離及其多樣性［J］.微生物學(xué)報(bào)，2012，52（7）：816-824.

Cao Yanru，Jiang Yi，Li Youlong，et al.Isolation methods and diversity of culturable fecal actinobacteria associated with Panthera tigris tigrisin Yunnan Safari Park［J］.Acta Microbiologica Sinica，2012，52（7）：816-824.

［19］羅紅麗，黃英，王黎明，等.西藏地區(qū)土壤放線菌種群多樣性及拮抗活性研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2005，45（5）：724-727.

LuoHongl i，H uang Ying，Wang Liming，et al.Study on population diversity and antimicrobial activity ofactinomycete from acidic soi lin Xizang area［J］.Acta Microbiologica Sinica，2005，45（5）：724-727.

［20］楊斌.放線菌分離方法的研究［D］.咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

Yang Bin.Study on the method of actinomycetes isolation［D］.Xianyang：North W est Agriculture and Eorestry University，2008.

［21］Kaeberlein T，Lewis K，Epstein S S.Isolating“uncultivable”microorganismsin pure culturein a simulated naturalenvironment［J］.Science，2002，296（5570）：1127-1129.

In situisolation of actinomycetes and screening bioactive potential from mangrove rhizosphere soilsin Guangxi

Jiang Mingguo1，2，Gan Guanghua1，2，Yang Lifang3，Li Xini2，Yang Guil iu2，Tuo Li4，Sun Chenghang4，H uang Ling3，Lan Jinzhi3
（1.Guangxi Key Lab ofM angrove Conservation and Utilization，Guangxi M angrove Research Center，Eeihai536000，China；2.School of M arine Sciences and Eiotechnology，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Eotanical Resources，Guangxi University for N ationalities，Guangxi N anning530008，China；3.Schoolof Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University for N ationalities Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Eorest Products，N anning530008，China；4.Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Institute of Medicinal Eiotechnology，Eeijing100050，China）

In orderto efficiently capture actinomycetesfrom mangrove rhizosphere soi lsin Guangxi，trapsfor particularly cultivating actinomycetesin situwereimplanted into soi l and wereincubated for thirty days.A general selec-tive isolation procedure was employed onto fifteen different media.Phylogenetic neighbour-joining tree was conducted on the 16S rR N A gene sequences ofthe isolates and type strains.The biological activities and enzyme production of the isolated strains were evaluated.One hundred thirty-three actinomycetes were recovered.Of the thirtythree randomly picked isolates，twenty wereStreptomyces，eleven wereNocardiopsisand one wasActinosynnema. One isolate，G X U N10，was most closely related toNocardiopsiswith a low 16S rR N A gene sequence identity of 90.0%，and mightrepresent a new genus.Seven，four，eighteen，six，ten and threeisolates showed antimicrobialactivities respectively toEscherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，Proteusbacillus vulgaris，HemolyticstreptococcusandPneumococcus.Eifty-five，sixty-two，twenty-two and seventy-two isolates respectively showed cellulase，amylase，collagen enzyme and esterase activities.This study provides further evidence that unusual and rare actinomycetes from mangrove rhizosphere soi lsin Guangxican be recovered byinsitucultivation traps.

in situcultivation；mangrove；rhizosphere soils；actinomycetes；biological activity

Q938

A

0253-4193（2015）02-0055-10

2014-01-12；

2014-05-02。

廣西紅樹(shù)林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（G K L M C-201204）；國(guó)家自然基金（31260004，81172963）；廣西自然基金（2012G X NSE A A053038）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金博導(dǎo)類項(xiàng)目（20111106110032）；廣西民族大學(xué)重點(diǎn)科研項(xiàng)目（2012 M DZD041）。

姜明國(guó)（1973—），男，吉林省長(zhǎng)春市人，主要從事微生物資源研究。E-mai l：mzxyj iang@163.com

楊立芳。E-mai l：yanglf1990@163.com