鄧斌格　成佳威

（湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199）

黃杯杜鵑總黃酮提取工藝研究

鄧斌格成佳威

（湖南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程系，湖南 永州 425199）

研究黃杯杜鵑總黃酮的最佳提取工藝。采用回流提取黃杯杜鵑總黃酮，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總黃酮提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取含量的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)選最佳提取工藝。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取次數(shù)3次、提取時(shí)間3h、液料比1:20(g/ml)條件下黃杯杜鵑總黃酮提取率高；正交試驗(yàn)結(jié)果表明：黃杯杜鵑總黃酮的最佳提取工藝為提取時(shí)間2 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取1次、料液比1 :25的條件下黃杯杜鵑總黃酮提取率較高；本工藝簡(jiǎn)單可行，有較好的參考價(jià)值。

黃杯杜鵑；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)

杜鵑花屬(Rhododendron Linn.)是杜鵑花科(Ericaceae) 中最大的一個(gè)屬，全世界約有960種，廣布于歐、亞、北美的溫帶地區(qū)[1]。我國(guó)是杜鵑花屬植物種類(lèi)最豐富的國(guó)家，是世界杜鵑花屬植物的主要分布中心[2]。該屬植物具有較高的藥用價(jià)值，如祛痰止咳[3-7]、抗菌消炎[8]、鎮(zhèn)痛[9-10]、對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)[11-13]等具有顯著作用，因此有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，黃杯杜鵑富含黃酮類(lèi)成分，其枝葉粗提物中總黃酮含量高達(dá)4.9%。本研究和實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)對(duì)黃杯杜鵑總黃酮提取，優(yōu)化其最優(yōu)提取工藝，得到黃酮純度高的粗提物，為合理開(kāi)發(fā)利用黃杯杜鵑植物資源提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

黃杯杜鵑葉（R.wardii）: 采自四川雅安，經(jīng)湖南科技學(xué)院姜紅宇博士鑒定。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海生化試劑公司）、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、二氯甲烷、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁，以上試劑均為分析純，全部購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠。

UV 2800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)舜宇恒平有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III循環(huán)水多用真空泵鄭州市長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備

稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10.0 mg，用80 %的甲醇定容至50 ml量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為0.2mg?ml-1的對(duì)照品溶液。

1.2.2總黃酮定量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14]分光光度計(jì)法

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、4. 0、5. 0、6. 0、8. 0、10. 0和12. 0 ml于25ml容量瓶中，各加入1. 25ml 5%亞硝酸鈉，搖勻。放置5min后再各加入10%硝酸鋁1. 25ml，搖勻。5min后再加入4%的氫氧化鈉溶液10ml，混勻并用80%甲醇稀釋至刻度。15min后于510nm處測(cè)吸光度（A），試劑為空白參比，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=10.274x+0.0461（R2=0.9939）。

圖1　蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4總黃酮提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、液料比(D)為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，每因素3 個(gè)水平(表1)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)(表2) ，優(yōu)化黃杯杜鵑總黃酮的提取工藝。

表1　黃杯杜鵑總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，精密稱(chēng)取黃杯杜鵑粉末1.00g（平行3份），在1.2.4節(jié)所得最佳提取工藝條件下提取黃杯杜鵑總黃酮，計(jì)算總黃酮提取率。

2　結(jié)果與分析

2.1影響總黃酮提取含量的單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間2h、提取2次的條件下，研究料液比對(duì)黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結(jié)果表明：隨溶劑量的增加，總黃酮提取含量明顯升高，當(dāng)料液比大于1:20(g/ml)時(shí)，提取含量升高速度減慢；小于1:20(g/ml)時(shí)，提取含量隨液料比的增加而增加。隨著溶劑量增加，質(zhì)量濃度梯度增大，總黃酮溶出速率和含量變大。當(dāng)總黃酮充分溶出后，即使繼續(xù)加大溶劑量，總黃酮的提取率基本趨于穩(wěn)定，甚至下降。在實(shí)際操作中考慮總黃酮的充分溶出同時(shí)也避免溶劑的浪費(fèi)，故正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中料液比設(shè)置為1:10～1:30(g/ml)。

圖2　液料比對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃杯杜鵑總黃酮提取率的影響

在料液比1:20、提取時(shí)間2h、提取2次的條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結(jié)果表明：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，總黃酮提取含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)50% 時(shí)達(dá)到最高值；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50% 時(shí)，總黃酮提取含量反而有所降低。造成這種現(xiàn)象可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，水溶性黃酮的溶出減少而脂溶性雜質(zhì)如色素、鞣質(zhì)等溶出增多，由于雜質(zhì)與脂溶性黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶劑，從而使黃酮提取量下降。故在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中

乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為30%～70%。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.1.3提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1:20、提取2次的條件下，研究提取時(shí)間對(duì)黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結(jié)果表明：黃杯杜鵑總黃酮提取含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)提取時(shí)間大于2h 后總黃酮提取含量趨于穩(wěn)定。在選擇提取時(shí)間時(shí)既要考慮有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫提取對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的影響，故正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中設(shè)置提取時(shí)間為1.0～3.0h。

圖4　提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.1.4提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1:20、提取2h的條件下，研究提取次數(shù)對(duì)黃杯杜鵑中總黃酮提取含量的影響。結(jié)果表明：黃杯杜鵑總黃酮提取含量隨提取次數(shù)的加大而升高，當(dāng)提取次數(shù)大于3次后總黃酮提取含量趨于穩(wěn)定。在選擇提取次數(shù)時(shí)既要考慮有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意多次的高溫提取對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的影響，故正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中設(shè)置提取時(shí)間為1～4次。

圖5　提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取含量的影響

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)選黃杯杜鵑總黃酮提取工藝

表2　總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、液料比等較優(yōu)水平，按L9( 34) 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃杯杜鵑總黃酮提取率影響最大，提取次數(shù)對(duì)黃杯杜鵑總黃酮提取率影響較大，其次，液料比對(duì)總黃酮的提取有一定影響，4個(gè)因素中，以提取時(shí)間影響最小；由正交試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)因素水平組合為A3B3C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)1次、料液比1 :25。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性，取5份黃杯杜鵑粗粉，沒(méi)份1.00g，按上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得平均總黃酮提取率為9.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.75%。所得總黃酮回收率高，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用。

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑，以黃杯杜鵑總黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)對(duì)提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)選出黃杯杜鵑總黃酮的最佳提取工藝為A3B3C1D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)1次、料液比1 :25。該工藝操作簡(jiǎn)便、成本低、收率高，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為黃杯杜鵑總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

[1]方瑞征,閔天祿.杜鵑屬植物區(qū)系的研究[J].云南植物研究,1995,17(4):359 -379.

[2]周三云,李蓉濤.杜鵑花屬植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2008,29(5):51-53.

[3]張均田.若干中草藥藥理和化學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),1979,1(2): 154 - 160.

[4]Fan C Q, Zhao WM, Ding B Y,et al. Cinstituents from the leaves of Rhododendron latoucheae [J].Phytochemical communication, 2002, (72): 449-452.

[5]Fan C Q,Yang G J,Zhao WM,et al. Qin G W.Phenolic components fromRhodedendron latoucheae[J].Chinese chemical letters, 1999, 10(7): 567 - 570.

[6]Hotta Y,Takeya K,Kobayashi S, et al. Relationship between structure,positive inotropic potency and lethal dose of grayanotoxins in guimea pig[J].Arch Toxicol, 1980,44(4):259 – 267.

[7]中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志(第3 冊(cè)) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1982.

[8]任茜,李強(qiáng),李萬(wàn)波,等.十種秦嶺杜鵑的抗菌作用研究[J].陜西林業(yè)科技, 1990,8(3):31-32.

[9]宋小平,陳志武,張建華.映山紅總黃酮的鎮(zhèn)痛作用[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2003,41(4):406-408.

[10]夏德超,楊天明.羊躑躅的研究進(jìn)展[J].中藥材,2002,25(11):828-831.

[11]汪為群,張艷,方志煉.金絲桃苷對(duì)心肌脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1995,11(2):123-125.

[12]曹文軍,陳瑞芬,劉國(guó)貞.槲皮素對(duì)缺血再灌大鼠心肌損傷的保護(hù)作用[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(3):311-313.

[13]范一菲,王云海,張建華,等.杜鵑花總黃酮對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中草藥,2008,39(2): 240-244.

[14]楊小鳳,朱一力,戴歌心.甌柑果皮中總黃酮的提取及含量的測(cè)定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2006,23(04):812-814.

(責(zé)任編校：何俊華)

R284.2

A

1673-2219（2015）05-0069-04

2015－01－11

鄧斌格（1994－），男，成佳威，湖南科技學(xué)院學(xué)生。