趙如奎，吳劍榮，詹曉北，朱 莉

(1.江南大學 生物工程學院糖 化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2.無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫 214125)

熊果苷(arbutin)屬氫醌苷化合物，化學名為4-羥基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等植物中，是一種新興的無刺激、無過敏、配伍性強的天然美白活性物質［1－2］。熊果苷具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，可減少酪氨酸酶在皮膚中的沉積，對皮膚有美白、防色變和祛斑的功效［3］。另外，熊果苷具有兩種同分異構體，分別是 α-熊果苷和 β-熊果苷。相關應用研究表明，α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10 倍以上［4－7］。α-熊果苷的美白機制是直接抑制酪氨酸酶活性，從而減少黑色素的生成，而不是通過抑制細胞生長或酪氨酸酶基因表達的方式來達到減少黑色素生成的目的。由于α-熊果苷是一種更高效、更安全的美白活性物質，國內(nèi)外許多家化妝品公司已采用α-熊果苷代替β-熊果苷作為美白添加劑［8－9］。

與β-熊果苷可通過植物提取、植物細胞培養(yǎng)和化學合成等方法來獲得的方式不同，α-熊果苷一般只能通過微生物細胞或者酶進行催化葡萄糖基糖轉移到氫醌上形成單一的α-熊果苷［10-12］。已報道用于合成α-熊果苷的酶包括從釀酒酵母中分離的α-葡萄糖苷酶［13］，從腸膜明串珠菌分離的葡聚糖蔗糖酶［14］以及淀粉蔗糖酶等［15］;葡萄糖基供體包括蔗糖、麥芽糖、濾紙粉、葡萄糖和對硝基葡萄糖苷等，α-熊果苷最高產(chǎn)量僅為 2.3 g/L［16-19］。另外，野油菜黃單胞菌由于含有轉葡萄糖苷酶，其凍干細胞或者細胞破碎懸液也可以用于催化α-熊果苷合成，產(chǎn)量分別為0.42 g/L和6.58 g/L，但是細胞質量濃度達到80 g/L，底物糖濃度比較高，糖轉化率低，給后續(xù)提取造成困難［4，20］。為了提高轉葡萄糖苷酶作用效率，Wu等［21］將野油菜黃單胞菌的轉葡萄糖苷酶基因表達并錨定在大腸桿菌表面，全細胞催化后，α-熊果苷產(chǎn)量可達21 g/L，氫醌轉化率為76%。另外，劉春巧課題組以嗜麥芽黃單胞菌為催化劑，嘗試采用發(fā)酵法和游離細胞進行催化反應，α-熊果苷可達12～16 g/L;進一步采用固定氫醌在樹脂方后進行全細胞催化，最終產(chǎn)量可達到65.9 g/L，氫醌轉化率為95.2%［22－25］。雖然發(fā)酵法或全細胞催化能夠得到較高濃度產(chǎn)物，但是發(fā)酵液復雜的成分給后續(xù)提取造成困難，且培養(yǎng)細胞和催化反應都需要較長時間。

環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glycosyltransfer，CGT酶，EC2.4.1.19)是一種胞外酶，可以分成 α-、β-和 γ-3 種類型，多用于制備α-、β-和 γ-環(huán)糊精［26］。CGT酶是一種多功能型酶，它能催化4種不同的反應:3種轉糖基反應(歧化反應、環(huán)化反應和偶合反應)和水解反應［27］。研究發(fā)現(xiàn)α-CGT酶還可以通過轉糖基反應催化轉苷，生成如維生素C葡萄糖苷、α-熊果苷等產(chǎn)物［28－31］。相比其他用于催化合成α-熊果苷的酶，α-CGT酶底物專一性較廣，轉葡萄糖基過程不需要耗能。

本文中，筆者嘗試利用國產(chǎn)安琪酵母公司的α-CGT酶為催化劑，以廉價麥芽糊精為葡萄糖基供體進行合成，再通過淀粉葡萄糖苷酶水解獲得α-熊果苷，為以商品化α-CGT酶生產(chǎn)制備α-熊果苷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

α-CGT酶，安琪酵母公司;淀粉葡萄糖苷酶，無錫杰能科生物工程公司;對苯二酚(HQ)、麥芽糖、CaCl2、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸，國藥集團化學試劑有限公司;麥芽糊精為市售產(chǎn)品(dextrose equivalent值(DE)分別4% ～6%、8% ～10%、10% ～15%);α-熊果苷標準品，Sigma-Aldrich公司。

1.2 α-熊果苷的合成

轉葡萄糖糖基反應:在20 mmol/L pH 6.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液體系中加入CaCl2(5 mmol/L)，對苯二酚(150 mmol/L)，麥芽糊精60 g/L和0.025 mg/mL α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶，于40℃、100 r/min水浴搖床中反應24 h，樣品沸水浴5 min滅活。

水解反應:高溫滅活后的樣品中加入淀粉葡萄糖苷酶，于40℃、100 r/min水浴搖床中反應4 h后，再次沸水浴5 min滅活，離心后經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析。

1.3 α-熊果苷的分析

取0.8 mL樣品，加入0.2 mL甲醇，在8000 r/min條件下離心10 min，上清液用LC-2010A型高效液相色譜檢測(日本島津)。色譜條件:色譜柱為島津 C18柱(4.6 mm ×25 cm，5 μm);柱溫為 30 ℃;流動相為H2O-CH3OH溶液，其體積比為80∶20;流速為0.6 mL/min;檢測器為紫外檢測器;檢測波長為 280 nm;進樣量為 10 μL。

1.4 對苯二酚轉化率計算

對苯二酚的轉化率計算見式(1)。

式中:n1為加入到發(fā)酵液中對苯二酚物質的量，n2為反應后發(fā)酵液中轉化為α-熊果苷的對苯二酚物質的量。

1.5 α-熊果苷的純化

樣品經(jīng)8000 r/min離心10 min，取上清液加入2倍體積乙酸乙酯，收集水相，再加入2倍體積正丁醇，收集水相，分別萃取3次，通過旋轉蒸發(fā)儀蒸干后收集樣品，即得初步純化的α-熊果苷。

1.6 α-熊果苷的結構測定

通過高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜技術(LCESI-MS/MS，TSQ Quantum Ultra EMR，Thermo Fisher Scientific)對產(chǎn)物進行鑒定。

色譜條件:色譜柱為Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱溫為 30 ℃;流動相為水(A)-甲醇(B)溶液。梯度洗脫(0～2 min 10%B、2～10 min 20%B、10 ～13 min 80%B、13 ～15 min 10%B);流速為 0.2 mL/min，進樣量為 1 μL。質譜條件:ESI離子源，正離子監(jiān)測模式檢測;噴霧電壓為3.2 kV;霧化器壓力為0.208 MPa;輔助氣壓力為0.208 MPa;離子傳輸毛細管溫度為350℃;數(shù)據(jù)采集掃描時間為0.50 s;分辨率Q1和Q3均為0.7 amu(FWHM);碰撞能量為15 eV。

2 結果與討論

2.1 對苯二酚的轉糖基反應

考察安琪酵母的α-CGT酶催化對苯二酚與麥芽糊精的轉糖基反應，結果如圖1所示。由圖1可知:α-CGT酶能夠使對苯二酚糖基化，形成具有不同葡萄糖基的糖苷混合物(HQGn)，其葡萄糖基的數(shù)量不等，保留時間均小于對苯二酚。首先，麥芽糊精作為供體與α-CGT酶的活性位點結合形成中間酶，通過水解不同的糖苷鍵，釋放出單糖、雙糖或低聚糖。然后，中間酶又與對苯二酚結合，對苯二酚的羥基與單糖、雙糖或低聚糖結合生成HQGn。同樣，HQGn也可以作為供體底物。當HQGn作為供體底物，對苯二酚(HQ)作為受體底物時，α-CGT酶切斷不同的糖苷鍵，從而也可生成HQG1～HQG4［31］。

圖1 α-CGT酶催化對苯二酚轉糖基反應的產(chǎn)物液相色譜Fig.1 Transglycosylation of hydroquinone with α-CGT by HPLC

2.2 糖苷的水解反應

淀粉葡萄糖苷酶(糖化酶)可以切斷α-糖苷鍵，將該酶加入上述轉糖基反應混合液中，可以將長鏈的葡萄糖切除，使得HQGn生成HQG1(α-熊果苷)。液相色譜分析結果如圖2所示。由圖2可知，圖中的峰分別為HQG1和未反應的對苯二酚HQ。因此，通過α-CGT酶和淀粉葡萄糖苷酶的兩步酶法反應體系，可以用于合成α-熊果苷。

圖2 糖化酶催化糖苷水解反應的產(chǎn)物液相色譜Fig.2 Hydrolysis of glycoside with glucoamylase by HPLC

2.3 催化反應條件的優(yōu)化

2.3.1 不同供體底物對反應的影響

分別考察葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精(DE值4% ～6%、8% ～10%、10% ～15%)作為 α-熊果苷的供體底物對反應的影響，結果見表1。由表1可知:所選底物中除葡萄糖外，麥芽糖、麥芽糊精均可作為供體底物生成α-熊果苷，其中采用DE值8% ～10%麥芽糊精的α-熊果苷產(chǎn)量最高，達到2.61 g/L。DE值4% ～6%麥芽糊精水溶性較差，水溶液黏度高，溶于水易形成凝膠。采用DE值10% ～15%麥芽糊精時，低分子葡萄糖較多，高分子葡萄糖較少，α-熊果苷產(chǎn)量要低于DE值8% ～10%麥芽糊精;麥芽糖僅由2個葡萄糖基組成，α-CGT也能催化糖基轉移反應形成少量α-熊果苷，表明該α-CGT的底物專一性不強，底物選擇范圍較大。作為參照，葡萄糖做為單糖無法被α-CGT識別［4］，未能檢測到α-熊果苷。相比多數(shù)研究以蔗糖、麥芽糖為葡萄糖基供體的酶催化反應［16-19］，本研究使用的麥芽糊精價格更低廉，并且α-熊果苷產(chǎn)量較高，但對苯二酚的轉化率要低很多。

2.3.2 麥芽糊精濃度對反應的影響

考察不同質量濃度的DE值為8%～10%麥芽糊精為底物對催化反應的影響，結果如圖3所示。由圖3可知:在一定麥芽糊精濃度范圍內(nèi)，α-熊果苷的產(chǎn)量隨著麥芽糊精濃度的升高而增加，當麥芽糊精達到60 g/L時，α-熊果苷的產(chǎn)量達到最大值2.58 g/L，對苯二酚轉化率為6.34%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)，繼續(xù)增加麥芽糊精用量，由于底物抑制作用，α-熊果苷產(chǎn)量基本不變，所以較適的麥芽糊精為60 g/L。該底物濃度與Shimoda等［30］所用的5%的濾紙粉用量相差不大。

表1 不同供體底物對α-CGT酶催化反應的影響Table 1 Effects of different substrates on the reaction catalyzed by α-CGT

圖3 麥芽糊精濃度對催化合成α-熊果苷的影響Fig.3 Effect of maltodextrin concentration on the synthesis of α-arbutin

2.3.3 對苯二酚濃度對反應的影響

圖4 對苯二酚濃度對催化合成α-熊果苷的影響Fig.4 Effect of hydroquinone concentration on the synthesis of α-arbutin

由于對苯二酚對酶具有抑制作用，當緩沖液中對苯二酚濃度超過一定量時，酶活性會下降。圖4為對苯二酚濃度對催化合成α-熊果苷的影響結果。由圖4可知:在一定對苯二酚濃度范圍內(nèi)，α-熊果苷的產(chǎn)量隨著對苯二酚濃度的增加而增加，最高產(chǎn)量為2.67 g/L，此時對苯二酚轉化率為6.54%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)。但當對苯二酚濃度超過150 mmol/L時，α-熊果苷的產(chǎn)量開始下降。這可能是由于對苯二酚的羥基比較活潑，對酶的活性中心和結構會產(chǎn)生影響，濃度過高會導致部分α-CGT酶活性下降甚至失活，最終導致α-熊果苷產(chǎn)量下降。與全細胞催化、細胞破碎懸液和發(fā)酵法制備α-熊果苷相比而言，商品化的α-CGT酶對對苯二酚的耐受性大大提高［19－20，22－23］。

2.3.4 溫度對反應的影響

考察反應溫度對催化反應的影響，結果如圖5所示。由圖5可知:α-熊果苷的最適反應溫度為40℃，此時產(chǎn)量達 2.59 g/L，對苯二酚轉化率為6.35%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)。在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度有利于提高酶的活性，當反應溫度過高時，會導致酶的催化能力下降。同時，隨著溫度的升高，對苯二酚氧化速度加快，反應體系中對苯二酚濃度下降，最終導致α-熊果苷產(chǎn)量下降。

圖5 溫度對催化合成α-熊果苷的影響Fig.5 Effect of temperature on the synthesis of α-arbutin

2.3.5 緩沖溶液pH對反應的影響

其他條件不變，考察不同pH的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液反應體系對酶催化反應的影響，結果如圖6所示。由圖6可知:當檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液的pH在6.0時，α-熊果苷的產(chǎn)量最高為2.62 g/L，對苯二酚轉化率為6.42%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)，這說明α-CGT酶在pH為6.0的緩沖溶液體系中活性達到最大。

圖6 緩沖液pH對催化合成α-熊果苷的影響Fig.6 Effect of buffer solution pH value on the synthesis of α-arbutin

2.3.6 反應時間對反應的影響

圖7為反應時間對催化反應的影響結果。由圖7可知:α-熊果苷產(chǎn)量隨著反應時間的延長先升高后降低，當反應時間為24 h時，α-熊果苷產(chǎn)量達到最高2.65 g/L，對苯二酚轉化率6.50%，生產(chǎn)速率為0.11 g/(L·h)。隨著反應時間的延長，α-熊果苷產(chǎn)量有所下降，這是因為α-熊果苷存在一個緩慢的水解過程。所以最佳反應時間為24 h。相比以往酶催化反應所需時間(48～96 h)和生產(chǎn)速率(8.33×10－4～1.53 ×10－2g/(L·h))，本研究的反應時間大大縮短，而生產(chǎn)速率提高一個數(shù)量級［22－25］。

圖7 反應時間對催化合成α-熊果苷的影響Fig.7 Effect of reaction time on the synthesis of α-arbutin

2.4 α-熊果苷的純化與鑒定

把反應所得到的樣品首先經(jīng)乙酸乙酯萃取，再經(jīng)正丁醇萃取，通過旋轉蒸發(fā)儀蒸干收集，得到的樣品再經(jīng)過離心，上清液用HPLC進行分析，并與α-熊果苷標準品的HPLC色譜圖進行比較，發(fā)現(xiàn)樣品與α-熊果苷有相同的保留時間，所以初步推斷樣品中含有α-熊果苷。再把萃取純化后的產(chǎn)物通過LC-ESI-MS/MS的正離子模式進行鑒定，結果如圖8所示。由圖8可知:α-熊果苷實際相對分子質量為272，產(chǎn)物相對分子質量與α-熊果苷標準品相對分子質量均為295，這是由于形成陽離子加合物［M+Na］+的結果。所以，可以確定產(chǎn)物為 α-熊果苷。

圖8 α-熊果苷的LC-ESI-MS譜圖Fig.8 Spectra of α-arbutin by LC-ESI-MS

3 結論

1)通過實驗證明了α-CGT酶能催化將麥芽糊精上葡萄糖轉糖基到對苯二酚上，合成α-熊果苷。較優(yōu)反應條件:DE 8%～10%的麥芽糊精作為供體底物，對苯二酚150 mmol/L，麥芽糊精60 g/L，pH 6.0，在40℃下反應24 h。通過對產(chǎn)物的分離提取、結構鑒定，確定該產(chǎn)物為α-熊果苷。

2)單純利用α-CGT酶也可催化合成α-熊果苷，但產(chǎn)量相對較低，并且副產(chǎn)物較多，給分離純化帶來困難。α-CGT酶和淀粉葡萄糖苷酶的雙酶催化法，不僅提高了α-熊果苷的產(chǎn)量，減少了副產(chǎn)物的生成，并且降低了分離純化難度，獨具優(yōu)勢。

3)酶法催化原料簡單，生產(chǎn)周期短，提取純化方便，但酶無法重復利用。下一步可考慮采用固定化酶催化合成α-熊果苷，固定化酶可重復利用，節(jié)約生產(chǎn)成本。

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