師文靜 廖莎 孫啟梅 王鵬翔 李曉姝

（中國石油化工股份有限公司　撫順石油化工研究院，撫順　113001）

東北地區(qū)產(chǎn)油能源微藻的篩選和鑒定

師文靜 廖莎 孫啟梅 王鵬翔 李曉姝

（中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院，撫順113001）

微藻作為21世紀(jì)生物柴油的理想燃料已被人們廣泛的關(guān)注，但是目前微藻種類很多，如何從諸多的微藻中篩選油脂含量高的微藻已成為人們函待解決的問題。從東北地區(qū)水樣中分離純化出93種藻種，采用尼羅紅染色法對其中30株藻種進行了篩選獲得了8種具有產(chǎn)油潛力的藻種，并利用自制的柱式反應(yīng)器微藻評價裝置對這8株藻株進行了產(chǎn)油能力的評價，獲得了一株總脂產(chǎn)率達到133.9 mg/（L·d）的產(chǎn)油能源微藻。在此基礎(chǔ)上，對該藻株進行了18S rRNA 的鑒定，確定為Chlorella sp.。

產(chǎn)油微藻；尼羅紅；分離純化；篩選；總脂產(chǎn)率；分子鑒定；18S rRNA

能源是社會發(fā)展的重要保證物質(zhì)，人類所使用的能源中88%來源于化石燃料［1］。然而目前人類所面臨化石燃料的日益短缺和燃燒所帶來的對全球生態(tài)環(huán)境的破壞，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類的生存。因此，積極尋找可再生的、環(huán)境友好型能源是當(dāng)今社會亟待解決的問題［2，3］。生物質(zhì)能源具有綠色和可再生性，發(fā)展生物質(zhì)能被認(rèn)為是解決全球能源危機的最理想途徑之一［4］。

微藻是生物質(zhì)能源的一種經(jīng)濟和高效原料［5］，高含油微藻藻株的篩選是實現(xiàn)微藻生物質(zhì)能制備技術(shù)的首要和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近些年來，美國、意大利、日本等國家的許多與微藻研究相關(guān)的實驗室在能源微藻的篩選方面開展了大量卓有成效的工作［6-9］。美國可再生能源實驗室［10］（NREL）建立的工程菌大多數(shù)屬硅藻菌種，在自然條件下微藻的脂質(zhì)含量為5%-20%時，工程微藻的脂肪含量是實驗室條件下增加至60%以上，在戶外擴大培養(yǎng)時脂肪含量40%以上。Rodolfi等［11］從30株淡水和海洋微藻中篩選出一株擬微綠球藻（Nannochloropsis sp. F&M-M24），其在營養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下，總脂含量為32%，總脂產(chǎn)率為117 mg/（L·d）。Mandotra等［12］采用改良的CHU-13培養(yǎng)基培養(yǎng)的柵藻（Scenedesmus abundans）藻株獲得最高總脂產(chǎn)率為124.71 mg/（L·d），對應(yīng)的總脂含量為43.91%。國內(nèi)許多研究機構(gòu)也正在積極開展含油微藻藻株的選育工作。到目前為止，國內(nèi)的相關(guān)研究報道主要是對實驗室現(xiàn)有藻種的總脂含量進行分析與評價，涉及的藻種主要是餌料藻和某些赤潮藻，如球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricomutum）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、綠色巴夫藻（Pavlovviridis）、鹽生卡盾氏藻（Chattonella subsalsa）、中肋骨條藻（Skeletonema costatum）等［13-20］。這些藻株中球等鞭金藻的總脂含量較高，蔣霞敏［10］的報道為32.96%，張秋會的報道是57%［15］?？姇粤幔?1］采用異養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞工程技術(shù)獲得了脂類含量為55%的小球藻（Chlorella protothecoides）。

微藻在自然界中分布廣，種類資源豐富，每年固定的CO2約占全球凈光合產(chǎn)量的40%，在能量轉(zhuǎn)化和碳元素循環(huán)中起到舉足輕重的作用。從環(huán)境中篩選生長速度快、生物量和油脂含量高、易培養(yǎng)的優(yōu)良微藻，是實現(xiàn)微藻規(guī)?；囵B(yǎng)的前體和保障［22-24］。本研究對從東北地區(qū)水體中分離的藻種進行篩選和產(chǎn)油性能的評價，目的是篩選出一株具有高產(chǎn)油性能的優(yōu)良性狀的微藻，并對篩選的微藻進行分子學(xué)水平上的鑒定，以期為后續(xù)建立高產(chǎn)能微藻的種質(zhì)庫，研究其產(chǎn)油代謝機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集和藻株的分離純化

野外水樣采自東北地區(qū)，浮游微藻采用1 L采水器采集水樣，底棲微藻采用刷子從水體中的石塊、船體、枝條等物體上刮取。采集的水樣用透明塑料瓶保存，然后帶入實驗室進行分離純化。

采集的水樣采用平板劃線法進行分離純化，培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基［25］，培養(yǎng)基組成見表1和表2。培養(yǎng)將使用無菌的線環(huán)，在無菌條件下將滴在瓊脂上的藻液平行劃在瓊脂表面上。在溫度為25℃，光照強度為3 000 Lux下培養(yǎng)4-8 d，挑取平板上的單藻落在裝有BG11液體培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)1周后鏡檢，重復(fù)數(shù)次，直到獲得純的單克隆藻株為止。

表1 BG11培養(yǎng)基

表2 A5+Co solution組成

1.2 尼羅紅染色法篩查藻種

將獲得的純藻種接種到50 mL搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)的光照強度為5 000 Lx，培養(yǎng)的光暗周期為24 h，光暗時間比為14∶10，每天定時搖動藻液2次避免藻液粘壁。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的藻液適量，8 000 r /min離心5 min，去除上清，藻細(xì)胞沉淀用PBS 洗兩次，采用體積分?jǐn)?shù)為20%的DMSO水溶液重懸藻細(xì)胞，使藻液OD540值0.8，40℃ 水浴20 min，按1 mL 藻液加15 μL 尼羅紅染料（質(zhì)量濃度為0.1 mg /mL 丙酮溶液），混勻染色5 min，激發(fā)波長480 nm，測定其在575 nm 波長的熒光強度來篩查藻種總脂含量的大?。?6］。

1.3 藻種培養(yǎng)評價實驗

將尼羅紅染色法篩查獲得的藻種分別接入微藻評價裝置中簡易的柱式反應(yīng)器，每個反應(yīng)器的裝液量為200 mL，在實驗室制作的微藻評價裝置上進行生長評價，微藻評價裝置如圖1所示。培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃，光照強度為5 000 Lux，通入空氣量為0.5 L/min，每天通入大約1 min CO2來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值不超過9，光照周期為24 h，光暗時間比為14∶10，培養(yǎng)時間為15 d處于穩(wěn)定期后結(jié)束收集藻液，凍干后測量干重和總脂含量。

圖1 微藻培養(yǎng)裝置

1.4 測定方法

1.4.1 生物量的測定 將處于穩(wěn)定期的藻液通過離心收集后在深冷冰箱中預(yù)凍2 h，在真空冷凍干燥機中干燥至恒重，稱量后得到藻粉的干重。

1.4.2 總脂含量的測定 參考文獻［27］中總脂含量的測定方法。

1.4.3 評價指標(biāo)計算方法 篩選生長優(yōu)勢的藻種主要用生物量產(chǎn)率來評價，即單位時間單位體積藻液的干重；篩選具有產(chǎn)油潛力的藻種用總脂產(chǎn)率來評價，即單位時間單位體積藻液的總脂產(chǎn)量。計算公式如下表示：

式中：m為收獲的藻粉的干重（g），V為藻液的體積（L），t為培養(yǎng)的時間（d），L為收獲的藻粉的總脂含量（%dw）。

1.5 藻種分子生物學(xué)鑒定方法

1.5.1 藻類基因組的提取和PCR的擴增 藻類基因組DNA 的提取采用改良的CTAB 法。收集對數(shù)生長期的藻泥，用蒸餾水清洗3 次，4℃，8 000 r/min 離心收集。加入4 mL CTAB 提取液，充分混勻，65℃水浴1 h。冷卻后加入等體積的Tris-飽和酚/氯仿（1∶1），混勻，4℃，12 000 r/min 離心 5 min，取上清液置于另一根離心管中。加入等體積的氯仿，抽提，取上清液置于另一根離心管中。每個離心管中加2倍體積無水乙醇，混勻，-20℃靜置4 h。取出，12 000 r/min，4℃離心4 min，棄上清，繼續(xù)用70%乙醇洗滌2次。沉淀加入20 μL 去離子水即為提取的藻類基因組DNA，-20℃保存。

1.5.2 18S rRNA基因的克隆 18S rRNA的擴增選擇真核生物18S rRNA通用引物（上游引物5'-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAG-TA-3'；下游引物：5'-CCTTGTTAACGAC TTCACCT TCCTCT-3'）［28］。PCR 反應(yīng)條件為：95℃變性5 min；然后94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，回收目標(biāo)DNA 片段，并將目標(biāo)片段連接到pMD18-T 載體上（TaKaRa公司），隨即選擇3個陽性克隆送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.5.3 序列分析 測序得到的分離藻株18S rRNA部分序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，根據(jù)同源性高低列出相近序列及所屬種或?qū)伲约霸逯晗嚓P(guān)信息，從而判斷18S rRNA鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離藻株的形態(tài)特征

通過在東北地區(qū)不同地點、時間采集的樣品經(jīng)過分離純化得到93株藻種，根據(jù)培養(yǎng)終期細(xì)胞液的顏色和性質(zhì)觀察，除去接團、粘壁、顏色渾濁的藻株，重點考察了30種性質(zhì)優(yōu)良的藻株，對這30種藻株進行了細(xì)胞形態(tài)和培養(yǎng)的特性的觀察，參考文獻《中國淡水藻類》進行初步分類，結(jié)果見表3。表3顯示，所分離的藻均為綠藻門藻種，說明綠藻在東北地區(qū)自然水體中具有明顯的生長優(yōu)勢，同一河流可以分離出不同屬的藻，不同河流也能有相同屬的藻，這些藻的種類大多集中于小球藻、柵藻、纖維藻和單針藻這幾類，纖維藻、單針藻、柵藻多以群生和對生的形態(tài)出現(xiàn)，小球藻細(xì)胞分散度好，多以單細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)。

2.2 尼羅紅染色法篩查藻株結(jié)果

本實驗對分離培養(yǎng)的30株藻采用尼羅紅染色法進行了篩選，所得的結(jié)果見表4。30種藻種中纖維藻為4種，柵藻為12種，小球藻為6種，單針藻為7種，綠球藻為1種。結(jié)果表明，不僅不同屬的藻種之間熒光強度有差別，而且同一屬的藻種之間的熒光強度差別也差別較大。其中纖維藻的熒光強度普遍較低，介于50.98-79.68之間，這與纖維藻的低油脂含量相關(guān)；單針藻的熒光強度偏高，最高的達到123.19，這與單針藻的高油脂含量相對應(yīng)；柵藻的種類比較多，熒光強度差別也較大，介于40-93之間，不同種的柵藻油脂含量差距較大；小球藻的熒光強度也較高，這與很多文獻［29，30］報道的球藻有較高的含油量相對應(yīng)，是具有潛力的能源微藻，為生物柴油的制備提供了具有潛力的油脂來源。根據(jù)微藻類別和熒光強度值比較，篩選出8株SH-S1、SH-S2、SF-S3、HCS-S1、FSH-S1、TMJ-S3、SS-S7和SS-S1熒光強度高的藻種作為油脂含量高的藻種作為進一步的評價對象。

表3 30株微藻細(xì)胞形態(tài)及培養(yǎng)特征

2.3 藻種產(chǎn)油潛力評價結(jié)果

通過尼羅紅染色法篩選的藻種的總脂含量都比較高（表5），均超過30%，其中SH-S1的總脂含量高達40%以上，并且熒光強度和總脂含量呈正相關(guān)關(guān)系，說明尼羅紅染色法是一種能夠有效的篩選獲得高油脂含量藻種的方法。SH-S1的油脂含量最高，為45.61%，但其生物量產(chǎn)率并不高；生物量產(chǎn)率最高的為SS-S7達到381.2 mg/（L·d），但其油脂含量卻較低，由此可見，生物量產(chǎn)率與總脂含量并不是正相關(guān)關(guān)系，僅用生物量產(chǎn)率或總脂含量一個指標(biāo)作為篩選高產(chǎn)油藻株的指標(biāo)是比較片面的，因此，引入總脂產(chǎn)率這個指標(biāo)來篩選高產(chǎn)油藻株。總脂產(chǎn)率為總脂含量與生物量產(chǎn)率的乘積，能夠表示單位體積單位時間的藻液的實際產(chǎn)油量，反映了藻細(xì)胞的實際油脂積累速率。同一種藻種由于培養(yǎng)條件的不同也會造成生物量產(chǎn)率和總脂含量的差異，一般來說同一藻種在不同培養(yǎng)條件下生物量產(chǎn)率高的總脂含量很可能會降低，因此，為了篩選藻種的基本產(chǎn)油能力，藻種評價均選擇了采用了適合大多數(shù)綠藻生長的BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時以藻種的總脂產(chǎn)率作為評價指標(biāo)進行藻種篩選，從表中可以看出，SF-S3總脂產(chǎn)率最高，達到133.9 mg/（L·d），為具有產(chǎn)油潛力的藻株。

表4 尼羅紅染色法篩查藻種結(jié)果

表5 不同藻株生物量及油脂含量的比較

2.4 高產(chǎn)油藻株的分子生物學(xué)鑒定

用通用引物對SF-S3藻株進行18S rRNA 的PCR擴增，得到預(yù)期長度的擴增產(chǎn)物（圖2），且產(chǎn)物條帶單一。圖2 顯示，藻株SF-S3 的18S rRNA PCR擴增片段的長度均在1 500 bp附近，測序結(jié)果在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性比對，18S rDNA序列相似度達到99%，下載相關(guān)序列，利用MEGA5.1軟件構(gòu)建進化樹。結(jié)果（圖3）表明，藻株SF-S3與多個Chlorella sp.的親緣關(guān)系最近，初步確定該藻屬于Chlorella sp.，即小球藻屬。

3 討論

自然界中存在著大約20萬種藻類，不同微藻之間的生物量產(chǎn)率和油脂含量存在著明顯的差異，許多藻株是具有開發(fā)和利用價值的產(chǎn)油微藻。本實驗從東北地區(qū)水域種分離出93種微藻，選取其中30種生長狀態(tài)好的藻種，采用尼羅紅染色法對產(chǎn)油微藻進行初步篩選，篩選獲得的藻株的油脂含量均大于30%，并且藻株的油脂含量與熒光強度成正相關(guān)關(guān)系，這與Alonzo 和Mayzaud［31］對浮游動物的脂類進行染色后發(fā)現(xiàn)其熒光強度與脂類濃度呈線性關(guān)系的結(jié)果類似。由于大多數(shù)藻種都有細(xì)胞壁，限制了尼羅紅進入藻細(xì)胞與脂類物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生熒光，本實驗采用了采用了王海英等［26］的改進的尼羅紅染色法，用DMSO滲透劑對藻液進行了預(yù)處理，結(jié)果表明該種尼羅紅染色法是一種很好的初級篩選含油藻的方法。

圖2 藻株SF-S3的18S rRNAPCR擴增產(chǎn)物

圖3 CC-B3的18S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹

本研究利用實驗室自制的通氣培養(yǎng)裝置對用尼羅紅染色法篩選出的8株產(chǎn)油微藻進行了通氣培養(yǎng)評價，通過測定生物量和油脂含量兩個指標(biāo)來評價產(chǎn)油微藻，結(jié)果表明，生物量和油脂含量不是正相關(guān)關(guān)系，油脂含量高的生物量不一定高。為了準(zhǔn)確地評價藻株的產(chǎn)油能力，引入總脂產(chǎn)率這個指標(biāo)來篩選高產(chǎn)油藻株?？傊a(chǎn)率為總脂含量與生物量產(chǎn)率的乘積，能夠表示單位體積單位時間的藻液的實際產(chǎn)油量，反映了藻細(xì)胞的實際油脂積累速率。通過8株藻株的油脂產(chǎn)率的比較，篩選獲得了油脂產(chǎn)率最高SF-S3藻株，油脂產(chǎn)率高達133.39 mg/（L·d）。 江麗麗等［32］篩選獲得的產(chǎn)油藻株凱氏擬小球藻C. kessleri HY-6培養(yǎng)結(jié)束時生物質(zhì)干重達到1.02 g/L，總脂含量為39.7%，總脂產(chǎn)率為50.8 mg/（L·d），SF-S3油脂產(chǎn)率為其的2.6倍。孫漫等［33］通過采用尼羅紅和油脂提取相結(jié)合的方法篩選獲得的產(chǎn)油量較高的琴式菱形藻在經(jīng)過Fe3+優(yōu)化后生物量最大（0.65 g/L），油脂產(chǎn)量為318.96 mg/L，本文所篩選的SF-S3的生物量是其的8.4倍，油脂產(chǎn)量是其的6.3倍。周文俊等［34］對富油微藻金藻Isochrysis sp. CCMM5001優(yōu)化培養(yǎng)條件并采用兩階段培養(yǎng)法后總脂含量和油脂產(chǎn)率分別高達63.3%和22 mg/（L·d），本研究所篩選的SF-S3的油脂產(chǎn)率是其的6.1倍。可見，藻株SF-S3具有較好的產(chǎn)油潛力，可作為進一步研究的能源微藻。

4 結(jié)論

從東北地區(qū)水樣中分離純化出93種藻種，獲得了8種具有產(chǎn)油潛力的藻種，并利用自制的柱式反應(yīng)器微藻評價裝置對這8株藻株進行了產(chǎn)油能力的評價，獲得了一株油脂產(chǎn)率達到133.9 mg/（L·d）的產(chǎn)油能源微藻。對該藻株進行了18S rRNA 的鑒定，確定為Chlorella sp.。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Selection and Identification of Oil-producing Energy M icroalgae in Northeast Region

Shi Wenjing Liao Sha Sun Qimei Wang Pengxiang Li Xiaoshu
（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals，SINOPEC，F(xiàn)ushun113001）

In the 21st century， the ideal microalgae biodiesel fuel has been widespread concern， but how to filter high in fat content from a lot of microalgae species has become a problem to be addressed. In this study， 93 strains of microalgae were isolated and purified from the water samples of the Northeast region， and 30 strains were screened to obtain eight oil-producing algae by Nile red fluorescence. Oil production capacity of these eight microalgae were evaluated with bubble column photobioreactor. This experiment obtained a higher oil yield algal and its total oil yield reached 133. 9 mg /（L· d）. On this basis an oil-producing energy microalgae was identificated by 18S rRNA. This oil-producing energy microalgae was identificated as Chlorella sp.

oil-producing microalgae；nile red；separation and purification ；screening；lipid productivity；molecular identification；18S rRNA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.035

2015-04-09

中國石化集團微藻生物柴油成套技術(shù)開發(fā)項目（210080）

師文靜，女，碩士研究生，研究方向：微藻生物能源；E-mail：shiwenjing.fshy@sinopec.com

廖莎，女，碩士研究生，研究方向：微藻生物能源；E-mail：liaosha.fshy@sinopec.com