王彧杰，王蓉，王媛媛，原永芳

·論著·

隱丹參酮對細(xì)胞色素P450酶CYP3A4和CYP2C9的影響*

王彧杰，王蓉，王媛媛，原永芳

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院藥劑科，上海201999）

目的研究丹參中脂溶性成分隱丹參酮對Chang肝臟細(xì)胞細(xì)胞色素P450酶（CYP450）CYP3A4、CYP2C9表達(dá)的影響，明確丹參主要成分對CYP450酶的作用，以闡明基于CYP450酶隱丹參酮與其他藥物間相互作用的分子基礎(chǔ)，為臨床合理使用含隱丹參酮的丹參制劑提供依據(jù)。方法采用CCK-8法考察隱丹參酮對Chang肝臟細(xì)胞活力的影響，以確定藥物的給藥劑量范圍；通過Western bloting法考察隱丹參酮在給藥后1、3和7 d對Chang肝臟細(xì)胞中CYP3A4和CYP2C9蛋白表達(dá)的影響；通過定量RT-PCR法考察隱丹參酮對Chang肝臟細(xì)胞中CYP3A4和CYP2C9 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果給藥1d，隱丹參酮對CYP3A4蛋白及mRNA表達(dá)無顯著影響。但隨時間延長，給藥3 d和7 d，隱丹參酮可抑制CYP3A4蛋白及mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。給藥1、3和7 d，隱丹參酮對CYP2C9蛋白及mRNA的表達(dá)均無顯著影響。結(jié)論連續(xù)給予隱丹參酮可抑制CYP3A4 mRNA和蛋白的表達(dá)。提示臨床在連續(xù)使用含隱丹參酮時，需要關(guān)注其與CYP3A4底物藥物之間可能的相互作用。

隱丹參酮；Chang肝臟細(xì)胞；CYP3A4；CYP2C9

隱丹參酮是丹參中主要脂溶性成分之一，屬于二萜醌類化合物，可抑制細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，具有抗炎和抑制免疫黏附的作用［1］，可用于心血管疾病的治療。近期研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮具有抗腫瘤活性，可以通過抑制mTOR信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長［2］；通過抑制血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］；通過抑制腫瘤細(xì)胞黏附而減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［4］。然而，已有研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮可影響其他藥物的代謝［5-6］。

近年來，隨著合理用藥認(rèn)識的不斷增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)許多中草藥存在藥物相互作用［7］。而這些相互作用大多與肝臟藥物代謝酶有關(guān)。在肝臟藥物代謝酶的研究中，細(xì)胞色素P450酶（cytochromes P450，CYP450）是一類重要的氧化酶系統(tǒng)，與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)［8］。約有75%的藥物通過CYP450酶系中CYP3A4［9］和CYP2C9［10］亞型代謝，是藥物代謝的主要途徑。在含有隱丹參酮成分的丹參制劑研究中已發(fā)現(xiàn)，丹參通過CYP3A4和CYP2C9與咪達(dá)唑侖［11］、5-氟尿嘧啶［12］、氯沙坦［13］、環(huán)孢素A［14］、華法林等［15］藥物間存在相互作用。隱丹參酮在肝微粒體中可競爭性抑制CYP2C9的活性［16］，然而隱丹參酮對肝細(xì)胞中CYP3A4、CYP2C9表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。故本研究將揭示隱丹參酮對CYP3A4和CYP2C9蛋白及mRNA的變化，進(jìn)而闡明隱丹參酮的藥物代謝途徑。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

Chang肝臟細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞研究所），RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清（美國Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、青-鏈霉素（美國Gibco公司），隱丹參酮（批號：110852，純度＞98%）（中國食品藥品檢定所），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒、苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、SDS-PAGE上樣緩沖液（江蘇碧云天生物有限公司），CYP3A4抗體（美國Merk Millipore公司），CYP2C9抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化酶標(biāo)記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（HRP-GAPDH，上?？党缮锕こ逃邢薰荆?，化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Thermo公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）。

1.2儀器與設(shè)備

恒溫二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Thermal公司），酶標(biāo)儀、免疫印跡電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-RAD公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（法國Vilber公司），PCR熱循環(huán)儀、7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Life Technologies公司），ND2000超微量分光光度計(jì)（美國nanodrop公司），低溫高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)Chang肝臟細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)單層貼壁細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化90 s、進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.2細(xì)胞存活率檢測取對數(shù)生長期的Chang肝臟細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔接種密度為1×105個/ml，在37℃、5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，棄去培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度的隱丹參酮（10、100、1 000、10 000μmol）的培養(yǎng)基100μl，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置只含細(xì)胞培養(yǎng)液的空白組、未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞對照組。在37℃、5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48 h后，加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，取上清液50μl，用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm處的吸光度值。其中細(xì)胞存活率（%）=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。As為實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8和隱丹參酮），Ac為對照孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基和CCK8，不含隱丹參酮），Ab為空白孔（不含細(xì)胞和隱丹參酮的培養(yǎng)基、CCK-8）。

1.3.3Western blot法細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，隱丹參酮高低劑量組每天分別給予10和100μmol隱丹參酮，CYP3A4和CYP2C9陽性對照組給予100μ mol利福平，CYP3A4陰性對照組給予100μmol濃度酮康唑。處理1、3和7 d后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，加入含有PMSF的蛋白裂解液裂解細(xì)胞200μl，收集各組細(xì)胞裂解產(chǎn)物，上述操作均在冰上進(jìn)行。裂解30 min后，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整蛋白濃度一致后，加入1/4體積的5×上樣緩沖液，渦旋混勻，在100℃水浴中煮沸10 min使蛋白變性。配制5%濃縮膠、10%分離膠，根據(jù)蛋白濃度決定加樣量。濃縮膠用電壓100 V電泳，當(dāng)樣品移動到分離膠后改用120 V電壓至結(jié)束。取下凝膠，在100 V電壓下，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜100 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。含有目的蛋白的PVDF膜分別加入一抗，CYP3A4（1∶2 000）、CYP2C9（1∶2 000），GAPDH（1∶5 000），4℃搖床孵育過夜。次日，用TBST溶液洗膜3次，后加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次；化學(xué)發(fā)光試劑顯色發(fā)光，通過凝膠圖像分析系統(tǒng)成像。

1.3.4定量RT-PCR法Chang肝臟細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種密度1×106個/ml，在37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁生長至70%時，每天隱丹參酮高低劑量組分別給予100μmol和10μmol隱丹參酮，CYP3A4和CYP2C9陽性對照組給予100μmol利福平，CYP3A4陰性對照組給予100μmol濃度酮康唑，空白對照組給予僅含有10%FBS、1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基溶液。處理1、3和7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后，依次加入Trizol、氯仿、異丙醇、75%酒精等試劑提取細(xì)胞總RNA，超微量分光光度計(jì)測定RNA濃度。根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再根據(jù)TaKaRa定量PCR試劑盒說明書，用cDNA作為模板，通過SYBR法進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s，PCR反應(yīng)95℃、5 s，60℃、34 s，循環(huán)數(shù)為40次，測定融解曲線，通過Ct值計(jì)算相對表達(dá)量2-△△Ct［17］。以GAPDH為內(nèi)參，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1　RT-PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

細(xì)胞活力測定和蛋白表達(dá)量測定采用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行定量PCR測定。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1隱丹參酮對Chang肝臟細(xì)胞存活率的影響

隱丹參酮在10、100和1 000和10 000μmol濃度下干預(yù)細(xì)胞24 h對細(xì)胞影響小，細(xì)胞生存率分別為（114.36±4.13）%、（76.43±3.32）%、（104.98± 7.50）%和（135.97±3.81）%，細(xì)胞存活率均高于50%。作用48 h后，細(xì)胞存活率略有下降，分別為（82.43± 8.01）%、（102.28±6.91）%、（99.49±8.26）%和（105.18± 0.67）%，但細(xì)胞存活率仍均高于50%。見圖1。

圖1　隱丹參酮對Chang肝臟細(xì)胞生存率影響

2.2隱丹參酮對CYP3A4、CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

2.2.1隱丹參酮對CYP3A4蛋白表達(dá)的影響10 μmol、100μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1 d后，CYP3A4蛋白的表達(dá)相比于空白對照組略有下降，結(jié)果分別為（0.84±0.05）和（0.91±0.03）。隨著隱丹參酮干預(yù)時間的延長，即3 d后，Chang肝臟細(xì)胞CYP3A4蛋白的表達(dá)較空白對照組比較有下降，結(jié)果分別為（0.68±0.83）和（0.78±0.13）。隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞7 d后，對CYP3A4蛋白的抑制作用更為明顯，結(jié)果分別為（0.60±0.13）和（0.70±0.02），與CYP3A4抑制劑酮康唑組對蛋白的抑制作用相近。見圖2。

2.2.2隱丹參酮對CYP2C9蛋白表達(dá)的影響10 μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1、3和7 d后，CYP2C9蛋白的表達(dá)與空白對照組相比CYP2C9蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果分別為（0.94± 0.14）、（0.96±0.20）和（0.83±0.19）。100μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1、3和7 d后，與空白對照組比較CYP2C9蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果分別為（1.19±0.24）、（1.05±0.09）和（1.10±0.15），見圖3。

2.3隱丹參酮對CYP3A4 mRNA、CYP2C9 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1隱丹參酮對CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響10μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1 d后對CYP3A4 mRNA表達(dá)無顯著影響，結(jié)果為（0.86± 0.19），而持續(xù)給予10μmol隱丹參酮3 d和7 d后CYP3A4 mRNA表達(dá)下降，結(jié)果分別為（0.31±0.09）和（0.56±0.04）。100μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1 d后對CYP3A4 mRNA的表達(dá)也無顯著影響，結(jié)果為（1.11±0.03），而持續(xù)給予100μmol隱丹參酮3d和7d后，逐步抑制CYP3A4 mRNA的表達(dá)，結(jié)果分別為（0.80±0.05）和（0.74±0.04），見圖4。

2.3.2隱丹參酮對CYP2C9 mRNA表達(dá)的影響10μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1、3和7 d后對CYP2C9 mRNA的表達(dá)無顯著影響，結(jié)果分別為（1.14±0.17）、（0.81±0.08）和（0.97±0.07）。100μmol隱丹參酮干預(yù)Chang肝臟細(xì)胞1、3和7 d后，也對CYP2C9 mRNA的表達(dá)無顯著影響，結(jié)果分別為（1.10±0.16）、（1.05±0.05）和（0.93±0.10）。見圖5。

圖2　隱丹參酮對CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

圖3　隱丹參酮對CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

圖4　隱丹參酮對CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響

圖5　隱丹參酮對CYP2C9 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

在Chang肝臟細(xì)胞的體外研究中，隱丹參酮對細(xì)胞毒性的影響較小，在10～10 000μmol濃度下培養(yǎng)48 h內(nèi)細(xì)胞生存率均大于50%。但隱丹參酮是丹參中的脂溶性成分，1 000μmol和10 000μmol的隱丹參酮不能完全溶解于PRMI 1640培養(yǎng)液中，而在前期研究中筆者發(fā)現(xiàn)常用的助溶劑——二甲亞砜會影響P450酶的表達(dá)［18］。此外已有文獻(xiàn)報(bào)道，1 000μmol、10 000μmol隱丹參酮干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞，細(xì)胞生存率低于50%［19-20］。因此，在研究隱丹參酮對CYP450酶的影響中，選用10μmol和100μmol兩個濃度。

研究結(jié)果表明10μmol和100μmol隱丹參酮可影響CYP3A4蛋白和mRNA的表達(dá)，而對CYP2C9蛋白及mRNA的表達(dá)無顯著影響。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮可以抑制LS174T細(xì)胞中PXR的表達(dá)［21］。PXR是CYP3A4基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，隱丹參酮可以通過PXR通路抑制Chang肝臟細(xì)胞中CYP3A4基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少CYP3A4 mRNA和蛋白的表達(dá)。然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隱丹參酮干預(yù)1 d沒有對CYP3A4 mRNA及蛋白的表達(dá)產(chǎn)生顯著的影響，但隨著干預(yù)時間的延長隱丹參酮可抑制CYP3A4蛋白和mRNA的表達(dá)。已有報(bào)道其他中草藥對P450酶系也存在相似的情況［22］，但機(jī)制尚不明確。由此提示在長期使用隱丹參酮時應(yīng)關(guān)注其與經(jīng)CYP3A4酶代謝的藥物間的相互作用。在慢性疾病或其他需要長期服藥的疾病中，許多藥物是CYP3A4代謝酶為底物，包括硝苯地平、氨氯地平、阿普唑侖、環(huán)孢素、他克莫司、辛伐他汀等。若在臨床上需長期聯(lián)合使用含隱丹參酮制劑與CYP3A4代謝酶為底物的藥物時，應(yīng)注意可能由于藥物代謝減慢而出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)10μmol和100μmol隱丹參酮對CYP2C9蛋白及mRNA的表達(dá)無顯著影響。這可能是因?yàn)楸M管隱丹參酮可抑制PXR的表達(dá)，但CYP2C9的轉(zhuǎn)錄還會受到HNF4［23］、GATA-4［24］、CAR等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，所以綜合因素下未受到影響。因此，隱丹參酮對細(xì)胞色素P450酶的影響應(yīng)主要關(guān)注其對CYP3A4的影響，而對CYP2C9無顯著影響。

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（張蕾編輯）

Effects of Cryptotanshinone on CYP3A4 and CYP2C9 expressions*

Yu-jie WANG，Rong WANG，Yuan-yuan WANG，Yong-fang YUAN
（Department of Pharmacy，the Third People's Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 201999，P.R.China）

【Objective】To investigate the effects of Cryptotanshinone on CYP3A4 and CYP2C9 expressions in Chang liver cells，confirm its effect on cytochrome P450 enzyme and analyze the drug-drug interaction so as to lay a foundation for rational medicine administration.【Methods】CCK-8 assay was performed to determine the proliferation of Chang liver cells after treatment with Cryptotanshinone for 1 day，3 and 7 days. Quantificational reverse transcription polymerase chain reaction and Western blot were performed to determine mRNA and protein expressions of CYP3A4 and CYP2C9 respectively.【Results】After 1-day treatment，Cryptotanshinone had no effect on protein or mRNA expression of CYP3A4.However，Cryptotanshinone significantly inhibited the mRNA and protein expressions of CYP3A4（P＜0.05）after 3-and 7-day treatment，and had no significant effect on the mRNA and protein expressions of CYP2C9 after 1-，3-or 7-day treatment.【Conclusions】Continual administration of Cryptotanshinone could inhibit the protein and mRNA expressions of CYP3A4，which suggests that the drug-drug interaction should be concerned about in clinic.

Cryptotanshinone；Chang liver cell；CYP3A4；CYP2C9

R943

A

1005-8982（2015）36-0001-06

2015-08-12

國家自然科學(xué)基金（No：81373375），上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院科研基金（No：14XJ10067）

原永芳，E-mail：nmxyyf@126.com；Tel：021-56786907