許立俠，郭紅延，郭紅梅，孫麗梅，徐紅梅

三維形貌測量激光顯微鏡下對早期釉質(zhì)齲的納米結構分析*

許立俠1，郭紅延2，郭紅梅2，孫麗梅1，徐紅梅2

（1.遼寧醫(yī)學院武警總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，北京100039；2.武警總醫(yī)院口腔科，北京100039）

目的本研究通過三維形貌測量激光顯微鏡觀察早期釉質(zhì)齲的納米結構變化，為齲病的預防及臨床治療提供理論依據(jù)。方法收集20顆因正畸拔除的新鮮前磨牙，隨機分為2組，實驗組（A組）與正常對照組（B組），A組暴露于人工脫礦液中4 d制備早期齲模型后，兩組均制備縱斷與橫斷面樣品，在三維顯微鏡下進行光學、激光彩色及3D圖像觀察。結果光學圖像可見A組表層完整，表層下白堊色，B組無此分層；激光彩色圖像觀察到A組表層釉柱晶體排列緊密，釉柱間質(zhì)正常，釉柱鞘清晰連續(xù)，表層下晶體溶解，排列混亂，釉柱間質(zhì)增寬，釉柱鞘不連續(xù)，B組結構正常；3D圖像更清晰顯示了A、B兩組的微結構形貌。結論三維顯微鏡能夠更清晰的顯示早期釉質(zhì)齲的表層及表層下的微晶結構，表層的相對完整性與再礦化有關，表層下以微晶體脫礦為主，是脫礦與再礦化連續(xù)動力學過程。

早期齲變；三維形貌；納米結構

齲病是牙齒硬組織的一種慢性感染性疾病，其病變是一種非細胞反應性病變，基本變化是脫礦與再礦化，并以脫礦為主［1］。牙釉質(zhì)是牙體組織中礦化程度最高的結構，大部分齲損都從釉質(zhì)開始，因此對釉質(zhì)齲的結構特性的研究對于齲病的防治尤為重要。以往對于早期齲變結構的觀察是通過透射、掃描電鏡［2］，而這些方法存在一些缺陷，觀察前對樣品脫水及真空處理會導致其結構的改變，且僅能以黑白色進行觀察，不能夠真實反映樣品的結構。而三維形貌測量激光顯微鏡作為微納米科學研究的重要工具之一，已經(jīng)廣泛應用于生命科學的研究，近年來，在口腔生物材料的研究領域也獲得了國內(nèi)外學者的親睞［3-4］。本文運用三維形貌激光立體顯微鏡對早期齲病及正常牙齒釉質(zhì)進行掃描成像，分別從整體、釉柱橫斷面及縱斷面進行對比分析，為牙釉質(zhì)的結構研究提供直觀的表象，為齲齒的預防及臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

Hank's平衡鹽溶液［5］：HBSS：400 mg/L氯化鉀（KCl），60 mg/L磷酸二氫鉀（KH2PO4），8 000 mg/L氯化鈉（NaCl），1 000 mg/L葡萄糖，90 mg/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）7H2O，350 mg/L碳酸氫鈉（NaHCO3），140 mg/L氯化鈣（CaCl2），100 mg/L硫酸鎂（MgSO4）7H2O和100mg/L氯化鎂（MgCl2）6H2O；人工脫礦液［6］：1.5 mmol氯化鈣（CaCl2），0.2 mmol磷酸氫鉀（KHPO4），50 mmol乙酸，0.02%的三氮化鈉（NaN3），在氫氧化鈉（NaOH）的調(diào)解下pH=4.5；三維形貌立體激光顯微鏡（VK—X100/X200，Keyence，日本）

1.2標本的收集與選擇

收集因正畸治療而新鮮拔除的雙尖牙，從中選取牙冠外形和顏色正常，釉質(zhì)發(fā)育完好、無齲病的20顆，去離子水下超聲去除表面軟組織、色漬及牙石并沖洗干凈后，置于4℃冰箱HBSS中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3牙齒標本的分組與處理

將20顆離體牙隨機分為兩組，A組：實驗組（早期齲病組）；B組：對照組（正常釉質(zhì)組）。將A組牙體頰側(cè)表面開窗4 mm×4 mm，其余部位涂布兩層抗酸指甲油，在人工脫礦液于37℃恒溫下放置4 d后，從人工脫礦液中取出，去離子水沖洗5 min，以去凈殘留的脫礦液；B組不經(jīng)特殊處理，作為正常對照組與齲病組進行對比。

1.4各組釉柱縱斷面的三維顯微鏡觀察

將脫礦后的A組隨機抽取5顆，通過開窗病變區(qū)用硬組織切片機將牙體組織沿牙體長軸，從頰舌向方向沿中線縱切成兩部分，暴露出釉柱縱斷面；同樣，B組中隨機抽取5顆，同A組切割方式一樣，暴露出釉柱縱斷面，然后用環(huán)氧自凝樹脂包埋各組牙齒并標記，拋光機及600#、800#、1000#、1200#、2000#碳化硅砂在流水下依次磨平、拋光后，超聲下清洗5 min，在三維形貌測量立體激光顯微鏡下進行觀察比較。

1.5各組釉柱橫斷面的顯微鏡觀察

將脫礦后A組中剩余的5顆牙齒，用硬組織切片機垂直于釉柱長軸，從近遠中方向沿中線橫切成兩部分，暴露出釉柱橫斷面；同樣，將B組中剩余的5顆牙齒，橫切暴露出釉柱橫斷面，環(huán)氧自凝樹脂包埋各組牙齒并標記，各組牙齒進行打磨、拋光，具體步驟同縱斷面處理方式。

2 結果

2.1整體結構的三維形貌顯微鏡觀察

在光學顯微鏡下觀察到，A組在400及1 000倍下可見一條較模糊的表層帶以及白堊色的表層下病損體部，而B組無此兩層結構，且整體結構完整（見圖1）。在激光彩色圖中可見，A組在400倍下可見一條清晰較完整的表層帶區(qū)域以及表層下脫礦的現(xiàn)象，在1 000倍下表層下生長線和釉柱橫紋清晰可見，在3 000倍下可見表層釉柱晶體排列緊密，釉柱間隙及釉柱鞘清晰連續(xù)，與B組相比，差異不大（見圖2）。

2.2兩組釉柱橫斷面的三維形貌顯微鏡觀察

激光彩色圖像中，A組牙釉質(zhì)表層下脫礦，釉柱頭部直徑變大，尾部排列不均勻，排列無序（見圖3A1），且釉柱間質(zhì)增寬，釉柱鞘不連續(xù)，晶體間可見大小不等的空隙（見圖3A2）。而B組牙釉質(zhì)中魚鱗狀釉柱清晰可見，頭部較大，尾部細長，排列均勻，緊密有序（見圖3B1），釉柱的直徑約5μm，與大多報道［7］平均直徑為4～6μm一致，釉柱鞘連續(xù)清晰可見（見圖3B2）。在3D形貌圖像中清晰立體的顯示早期齲及正常組牙釉質(zhì)的三維結構（見圖4）。

圖1　兩組整體結構的光學鏡下觀察圖

圖2　兩組整體結構的激光彩色形貌圖

圖3　釉柱病損體部橫斷面的形貌觀察圖

圖4　釉柱病損體部橫斷面的3D觀察圖

2.3兩組釉柱縱斷面的三維形貌顯微鏡觀察

激光彩色圖像可見A組牙釉質(zhì)表層下脫礦晶體大小不均勻，排列雜亂無序，釉柱間質(zhì)增寬，釉柱鞘也呈斷續(xù)排列，晶體間可見大小不等的空隙（見圖5A）。B組牙釉質(zhì)顆粒大小均勻，顆粒間排列方向一致，緊密有序，形成長條索狀結構的釉柱，釉柱鞘連續(xù)清晰可見（見圖5B）。兩組對應的3D形貌圖（見圖6），能更清晰立體的顯示早期齲及正常牙釉質(zhì)的三維結構。

圖5　釉柱病損體部縱斷面的形貌觀察圖

圖6　釉柱病損體部縱斷面的3D觀察圖

3 討論

三維形貌測量激光顯微鏡是一種集顯微鏡、SEM、粗糙度于一身的非接觸式表面形貌儀，以微納米尺度對樣品三維表面形貌進行測量，測量精度可達到0.001μm。其成像原理采用“激光光源”和“白色光源”2路光源方式。通過這2個光源獲得構建彩色全焦點圖像、激光全焦點圖像、高低圖像所必要的色彩、光量、高度的信息。首先通過短波長激光檢測反射光量和高度。從激光顯微系統(tǒng)的激光光源發(fā)出的光線介由XY掃描光學系統(tǒng)、接物透鏡聚光至對象物體上。聚光后的點光源通過XY掃描光學系統(tǒng)在觀察視野內(nèi)進行面掃描。在觀察視野內(nèi)分割成1024×768像素運行掃描，并由受光組件檢測各像素的反射光。將接物透鏡在Z軸方向上驅(qū)動，反復運行面掃描，獲得各像素的各Z軸位置處的反射光量。并將反射光量最高的Z軸位置設為焦點，檢測高度信息和反射光量。這樣便可以獲得整體對焦的光量全焦圖像和高低圖像信息。其次，使用彩色CCD攝像機檢測白光源的發(fā)射光。CCD攝像機在每個像素的基礎上，使用激光束獲取焦點位置的顏色信息。因此三維形貌測量激光顯微鏡可以完成SEM無法實現(xiàn)的真彩觀察。趙曉一等［8］曾用3D激光掃描顯微系統(tǒng)清晰地觀察到滲透樹脂深入到病損牙體的深入層。

牙釉質(zhì)由羥基磷灰石晶體有序排列形成，早期釉質(zhì)齲又稱“白斑”病損［9］，組織病理學上分為4層：表層、病損體部、暗層及透明層，但在人工齲模型中僅能觀察到表層及病損體部［10］。而病損體部脫礦最為明顯，是研究齲病脫礦機制的良好模型。兩組整體結構中，A組在光學顯微鏡下僅能觀察到一條模糊的表層帶和白堊色的病損體部，微結構難以辨識；但在激光彩色圖中不僅可以觀察到較清晰完整表層及表層下脫礦的現(xiàn)象，而且還可觀察到表層晶體的有序排列，釉柱間質(zhì)和釉柱鞘的清晰連續(xù)。B組結構完整，未出現(xiàn)此分層。證實早期齲損是脫礦和再礦化連續(xù)的動力學過程［11-13］，所形成的齲損仍具有相對完整的表層結構，同時也意味著，此時將人工齲浸入再礦化液中，可以終止齲病的發(fā)展，使其再礦化恢復到正常釉質(zhì)組織。

在橫斷面中，激光彩色圖像觀察到A組可見整體釉柱頭部直徑變大，釉柱間質(zhì)增寬，靠近柱間區(qū)的釉柱晶粒體積較大，邊緣圓鈍，此處晶體破壞程度較釉柱中心區(qū)輕。在釉柱中心部的多數(shù)晶粒出現(xiàn)中心溶解，相鄰的晶粒中心穿孔可彼此融合形成大的孔隙，釉柱鞘連續(xù)性中斷；而B組無此現(xiàn)象。趙瑋等［14］應用透射電鏡在早期齲年輕后牙的牙釉質(zhì)中觀察到了同樣的現(xiàn)象，但僅以黑白色二維進行觀察，結構不是十分清楚。而本實驗中激光彩色和3D圖進一步立體形象的顯示表層及表層下釉柱晶體的三維彩色病理變化，認為釉柱間區(qū)顯示對齲溶解較強的抵抗力［15］。有研究表明［16］，早期齲變首先是碳酸根和鎂離子的溶出，該元素主要分布在釉質(zhì)的羥基磷灰石晶體的中央和周緣，易受到菌斑下酸的侵襲首先發(fā)生溶解。

在縱斷面中，激光彩色圖像觀察到A組牙釉質(zhì)表層下脫礦晶體大小不均勻，排列雜亂無序，釉柱間質(zhì)增寬，釉柱鞘也呈斷續(xù)排列，此處晶體表現(xiàn)為大小不等的六角形或不規(guī)則形的白亮點散布于柱間區(qū)，晶體間可見大小不等的空隙。有學者［17］應用偏光顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察早期牙釉質(zhì)齲和人工齲損害的破壞途徑中得出酸對釉質(zhì)的損害首先發(fā)生在釉柱鞘，其次是釉柱心和釉柱間質(zhì)的結論。在激光彩色圖和3D圖中通過和B組相比較進一步直觀形象的展示了這一點。

綜上所述，本研究更清晰地觀察到早期齲病的表層及表層下脫礦的三維形貌，通過和正常牙釉質(zhì)微結構比較進一步證實早期齲表層的完整性與再礦化有關、釉柱周邊對齲溶解具有較強的抵抗力、晶體中心優(yōu)先溶解。為下一步研究早期齲病的再礦化形態(tài)學研究奠定理論基礎，同時對防治齲病具有重要的臨床指導意義。

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（張蕾 編輯）

Three-dimensional and laser characterization of incipient in vitrocarious lesions in human dental enamel*

Li-xia XU1，Hong-yan GUO2，Hong-mei GUO2，Li-mei SUN1，Hong-mei XU2
（1.Graduate Education Base，General Hospital of Armed Police Force，Liaoning Medical University，Beijing 100039，P.R.China；2.Department of Stomatology，General Hospital of Armed Police Force，Beijing 100039，P.R.China）

【Objective】To examine the nanostructure of incipientin vitrocarious lesions in dental enamel using three-dimensional topography and laser microscope.【Methods】Twenty fresh premolar teeth in orthodontic pulling were collected and randomly divided into experimental group（group A）and normal control group（group B）.In the group A incipient carious lesions were obtained on the buccal side by exposure to artificial demineralization liquid for 4 days.The teeth in the two groups were then cut in longitudinal section and cross section.The sections were then examined using the three-dimensional and laser morphology.【Results】The group A showed little evidence of lesion growth on surface or demineralization under the surface in the optical imagery.But under laser microscope，the group A showed that surface enamel rod crystals were aligned closely，enamel rod sheath was clear and continuous；the crystals of subsurface dissolved disorderly，the interval of enamel rod broadened，enamel rod sheath was fuzzy and discrete.However，the group B did not have this performance in the laser color images.3D images more clearly showed the microstructure characteristics of the two groups.【Conclusions】Three-dimensional topography laser stereo microscope can accurately show morphology and structure of surface and subsurface of incipient carious lesions.The integrity of the surface is related to remineralization，and the subsurface mainly undergoes demineralization of micro-crystals.The pathologyical changes of the two layers are through a coupling diffusion process.

caries enamel；nanomechanical structure；three-dimensional topography

R781.1

A

1005-8982（2015）36-0016-05

2015-08-06

武警總醫(yī)院院內(nèi)資助項目（No：WZ201024）

徐紅梅，Tel：010-57976698；E-mail：h_m_xu@163.com