羅琦　劉凱

陜西省寶雞市第二人民醫(yī)院骨科，陜西寶雞721000

細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)法對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型維持效果的研究

羅琦劉凱

陜西省寶雞市第二人民醫(yī)院骨科，陜西寶雞721000

目的探索并構(gòu)建一種操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本較低，且能夠較好維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系。為建立表型穩(wěn)定的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞庫提供新思路。方法改良式三步酶解消化法獲取兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為原代種子細(xì)胞。分別進(jìn)行常規(guī)單層貼壁培養(yǎng)法擴(kuò)增傳代和細(xì)胞團(tuán)塊-懸浮培養(yǎng)并傳代。流式細(xì)胞儀法對(duì)比兩種培養(yǎng)體系軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。免疫組化技術(shù)和Western bolt法對(duì)比兩種培養(yǎng)體系中次代軟骨細(xì)胞標(biāo)志性產(chǎn)物Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果①兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在常規(guī)單層貼壁培養(yǎng)體系中擴(kuò)增較快，但迅速失去圓形外觀，并逐漸形成類似于纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形外觀，即發(fā)生去分化現(xiàn)象。免疫組化染色和Western bolt檢測(cè)結(jié)果顯示，Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)能力隨著傳代次數(shù)增加而遞減，到P4代細(xì)胞基本不表達(dá)。②懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞擴(kuò)增較慢，其生長(zhǎng)曲線近似于原代軟骨細(xì)胞。各代細(xì)胞聚集成團(tuán)，最大可獲得直徑約4 mm的軟骨細(xì)胞團(tuán)塊，單個(gè)細(xì)胞保持圓形或類圓形外觀。各代細(xì)胞的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平基本穩(wěn)定，并可在細(xì)胞周圍形成含有Ⅱ型膠原蛋白的類似于細(xì)胞外基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論懸浮培養(yǎng)模式較為接近軟骨細(xì)胞的生理?xiàng)l件，可獲得表型較穩(wěn)定的關(guān)節(jié)軟骨子代細(xì)胞，并保持了Ⅱ型膠原蛋白合成和分泌能力，可能作為軟骨組織工程研究的種子細(xì)胞來源之一。

透明軟骨；去分化；懸浮培養(yǎng)；組織工程

足夠數(shù)量的表型正常的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程和軟骨相關(guān)研究的基礎(chǔ)。但是，在常規(guī)貼壁式單層培養(yǎng)體系中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞因生長(zhǎng)條件的變化和細(xì)胞外基質(zhì)的缺失，導(dǎo)致子代細(xì)胞難以維持相對(duì)正常的表型。該現(xiàn)象已成為限制軟骨組織工程領(lǐng)域研究和臨床應(yīng)用的瓶頸問題之一。為解決這一問題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行大量探索，以求盡可能模擬接近生理?xiàng)l件的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。其中較為成功的培養(yǎng)模式包括生物反應(yīng)器培養(yǎng)以及構(gòu)建各種生物支架培養(yǎng)模式。但往往因設(shè)備費(fèi)用昂貴、操作過程復(fù)雜及支架材料獲取相對(duì)困難等諸多因素影響其廣泛應(yīng)用［1，4，5，9］。

本研究在總結(jié)前人研究經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過改良三步酶消化法獲取兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞［2，6］，分別構(gòu)建瓊脂板-軟骨細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)體系和常規(guī)單層貼壁培養(yǎng)體系［1，3，8］，進(jìn)行體外擴(kuò)增和傳代。通過觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)情況綜合判斷表型維持情況，現(xiàn)報(bào)道如下：

1　對(duì)象與材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔10只，3個(gè)月齡，體重2.4～2.7 kg，雌雄不限，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（陜）2014-003。

1.2儀器與試劑

超凈臺(tái)（美國(guó)LABCONCO公司）、培養(yǎng)箱（HERA CELL）、Olympus相差顯微鏡、流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur）。胰蛋白酶、睪丸透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原蛋白酶等均購自上海微科生化試劑有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清購自Gibco生物科技有限公司；分析純瓊脂糖粉購自西安化學(xué)試劑有限公司；Ⅱ型膠原蛋白抗體、GAPDH抗體均購自上海微蒙生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞懸液的制備

無菌條件下取雙側(cè)肱骨、股骨遠(yuǎn)近端關(guān)節(jié)軟骨和脛骨近端關(guān)節(jié)軟骨，切成約1 mm×1 mm×1 mm的軟骨塊，用含有青霉素和鏈霉素的聚丁二酸丁二醇酯（PBS）溶液反復(fù)沖洗。采用改良三步酶消化法分離軟骨細(xì)胞：第一步，用0.25%胰蛋白酶/PBS溶液，在37℃搖動(dòng)式恒溫水浴箱中消化30 min。用PBS溶液沖洗軟骨塊。第二步，取適量0.2%睪丸透明質(zhì)酸酶-DMEM/F12溶液消化1 h，條件同上。之后用PBS沖洗。第三步，用適量0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶-DMEM/F12溶液，消化4 h。在此消化過程中每隔1 h用玻璃滴管手動(dòng)輕柔吹打5 min，收取酶液，加入新的Ⅱ型膠原蛋白酶液，繼續(xù)消化。在顯微鏡下觀察直到?jīng)]有軟骨細(xì)胞從殘存基質(zhì)上釋放。收集含有軟骨細(xì)胞的消化液，1000 r/min離心10 min后用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，200目濾網(wǎng)過濾。最后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將全部細(xì)胞重懸。

1.3.2體外培養(yǎng)和傳代

1.3.2.1單層貼壁式培養(yǎng)體系的建立和傳代用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液將軟骨細(xì)胞懸液調(diào)整到5×105個(gè)/mL，種植在底面積為75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后第1次更換培養(yǎng)液，以后每隔48 h換液1次，記錄形態(tài)學(xué)變化。培養(yǎng)達(dá)到約70%融合程度時(shí)分瓶傳代培養(yǎng)。共實(shí)施4次傳代，原代細(xì)胞命名為P0，以此類推。

1.3.2.2瓊脂板-軟骨細(xì)胞團(tuán)懸浮式培養(yǎng)體系的建立和傳代取2 g瓊脂糖粉，加入98 mL PBS溶液，煮沸至瓊脂糖粉完全溶解并拌均勻。冷卻后即形成2%的瓊脂凝膠。使用水浴加熱至凝膠徹底融化。取1 mL瓊脂糖溶液，加入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，沿水平方向迅速搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使瓊脂糖均勻地鋪在皿底，靜置至瓊脂糖徹底凝固，培養(yǎng)皿底部即形成一層完整均勻的瓊脂板。

取適量軟骨細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液調(diào)整到5×105個(gè)/mL，種植在預(yù)鋪瓊脂板的培養(yǎng)皿中。48 h左右軟骨細(xì)胞即形成懸浮的細(xì)胞團(tuán)塊，進(jìn)行首次換液。以后每隔48 h換液1次。觀察培養(yǎng)過程中細(xì)胞團(tuán)塊體積變化，通常至6 d左右細(xì)胞團(tuán)塊不再增大，即作為傳代的時(shí)機(jī)。傳代時(shí)收取細(xì)胞團(tuán)塊，用Ⅱ型膠原蛋白酶DMEM/F12溶液消化1 h，每隔30 min輔以輕柔吹打2 min，直至軟骨細(xì)胞完全分散。

1.3.3兩種培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究

應(yīng)用流式細(xì)胞儀熒光計(jì)量法繪制兩種培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。取48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為A、B兩組，分別用于單層貼壁式培養(yǎng)（A組）、懸浮式培養(yǎng)（B組）。將原代軟骨細(xì)胞按照前面所述的培養(yǎng)方法分別種植在A、B兩組的瓊脂板上。每天從每個(gè)培養(yǎng)體系中取12個(gè)孔的樣本用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以P0細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值為標(biāo)準(zhǔn)，將子代細(xì)胞樣本的熒光強(qiáng)度值與之相比，所得比值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，擴(kuò)增倍數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)檢測(cè)

以A組和B組的P0、P2、P4代細(xì)胞為研究對(duì)象，依標(biāo)準(zhǔn)流程分別進(jìn)行Ⅱ型膠原蛋白免疫組化和Western blot檢測(cè)。

1.3.4.1免疫組化取樣本細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，經(jīng)PBS沖洗后用山羊血清封閉液孵育20 min，以此滴加Ⅰ抗、Ⅱ抗（生物素標(biāo)記）并分別在37℃孵育1 h，DAB顯色后蘇木精復(fù)染2 min，封片并鏡檢。結(jié)果判定：免疫組化結(jié)果表現(xiàn)為無染色、淺黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和耀眼可見的褐黃色粗顆粒，分別記為陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性。

1.3.4.2 Westernblot取樣本細(xì)胞懸液，4℃下12000r/min離心5 min，取上清于-20℃保存。制備12%聚丙烯酰胺凝膠。充分凝固后，放入電泳槽，加入電沖液，取約10 μg處理好的蛋白樣品上樣電泳。電泳完成后將電泳膠置轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20 min。并將硝酸纖維素膜于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20 min。轉(zhuǎn)膜順序：負(fù)極-專用濾紙-電泳膠-硝酸纖維素膜-專用濾紙-正極。室溫下轉(zhuǎn)膜120 min。轉(zhuǎn)膜所得的硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。之后分別進(jìn)行一抗孵育（稀釋比例為1∶200）和二抗孵育（稀釋比例為1∶1000），用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和分析。

2　結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)結(jié)果

2.1.1單層貼壁式培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

原代軟骨細(xì)胞植入普通培養(yǎng)瓶后，數(shù)小時(shí)即開始貼壁，24 h內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞完成貼壁。貼壁后的細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形和多角形。原代細(xì)胞培養(yǎng)1周左右達(dá)到80%的融合。顯微鏡下觀察絕大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，胞漿內(nèi)可見較多的囊泡樣結(jié)構(gòu)，為富含Ⅱ型膠原蛋白的基質(zhì)小泡。

第1次傳代之后的軟骨細(xì)胞（P1）貼壁速度較原代細(xì)胞明顯增快，基本上在6 h之內(nèi)就完成貼壁，培養(yǎng)7 d時(shí)達(dá)到80%融合，胞漿內(nèi)可見基質(zhì)囊泡。P2代軟骨細(xì)胞貼壁更快，4 h左右即完成貼壁。從P2開始，軟骨細(xì)胞形態(tài)變得更加細(xì)長(zhǎng)。同時(shí)，軟骨細(xì)胞的增殖速度亦有所加快，在培養(yǎng)6 d左右即可達(dá)到70%的融合，但是胞漿內(nèi)基質(zhì)囊泡明顯減少。在P3～P4階段，增殖更為迅速，4～5 d即可達(dá)到70%的融合，但是細(xì)胞形態(tài)越來越接近長(zhǎng)梭形，類似于成纖維細(xì)胞，胞漿內(nèi)基質(zhì)囊泡基本消失。原代軟骨細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)完全消失。見圖1。

圖1　單層貼壁式培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.1.2瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮式培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

原代軟骨細(xì)胞種植在預(yù)鋪有瓊脂板的培養(yǎng)皿中后，48 h內(nèi)即可形成肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)塊，直徑約為1.5 mm，呈不透明的類圓形團(tuán)塊，懸浮于培養(yǎng)液中。鏡下觀察，軟骨細(xì)胞團(tuán)塊較松散。隨后，細(xì)胞團(tuán)塊的體積逐漸增大。懸浮培養(yǎng)10 d左右最大的細(xì)胞團(tuán)塊直徑可達(dá)到4 mm。鏡下觀察細(xì)胞緊密排布，基本上不能分辨細(xì)胞輪廓。此后，細(xì)胞團(tuán)塊體積不再增大，培養(yǎng)至14 d后體積反而有所縮小。P1～P4代軟骨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所得的細(xì)胞團(tuán)塊在鏡下觀察形態(tài)無顯著改變。見圖2。

圖2　瓊脂板-懸浮培養(yǎng)的P4代軟骨團(tuán)塊

2.2單層貼壁式培養(yǎng)和懸浮式培養(yǎng)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)

2.2.1軟骨細(xì)胞在單層貼壁式培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)

(1) 針對(duì)柴儲(chǔ)混合電力系統(tǒng),提出了柴油發(fā)電機(jī)和儲(chǔ)能系統(tǒng)間的負(fù)荷頻率協(xié)調(diào)控制,通過將調(diào)頻信號(hào)精細(xì)化處理為高低頻分量,由柴油發(fā)電機(jī)和儲(chǔ)能系統(tǒng)分別承擔(dān)低頻分量和高頻分量,以實(shí)現(xiàn)不同發(fā)電裝置對(duì)頻率管理的協(xié)調(diào)控制,提高了發(fā)電裝置的利用率。

原代細(xì)胞培養(yǎng)初期，細(xì)胞增殖較慢，生長(zhǎng)曲線坡度較為平緩。經(jīng)過4 d左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)曲線的坡度較前陡峭；培養(yǎng)8 d后形成接近水平的平臺(tái)期；繼續(xù)培養(yǎng)至10 d以上進(jìn)入衰退期，生長(zhǎng)曲線向下轉(zhuǎn)折。

隨著傳代次數(shù)的增加，軟骨細(xì)胞增殖周期漸縮短；到了P4階段，只需1.5 d左右即可進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期，生長(zhǎng)曲線不具有平臺(tái)階段；在5 d左右進(jìn)入衰退期。見圖3。

2.2.2軟骨細(xì)胞在瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)

在瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮式培養(yǎng)體系中，各代次的軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線模式高度一致，起始部分很平緩，從第3天起，曲線坡度逐漸升高，但始終未達(dá)到貼壁式培養(yǎng)的上升速度；到培養(yǎng)的第10天后，曲線的斜率又逐漸趨于平緩；培養(yǎng)至13 d以上時(shí)，曲線略向下轉(zhuǎn)折，進(jìn)入生長(zhǎng)的衰退期。與單層貼壁式培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞比較，懸浮培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)更為穩(wěn)定，且更接近于原代軟骨細(xì)胞。見圖4。

圖3　單層貼壁式培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖4　瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.3兩種培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平的比較

2.3.1單層貼壁式培養(yǎng)環(huán)境中軟骨細(xì)胞免疫組化特點(diǎn)

為了明確不同培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行免疫組化研究。結(jié)果顯示，原代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，單層貼壁式培養(yǎng)組傳代至第二代時(shí)，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低，傳代至第四代時(shí)，幾乎不表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白。而各代次細(xì)胞之間，均無Ⅱ型膠原陽性染色表現(xiàn)。見圖5。

圖5　單層貼壁式培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原蛋白（免疫組化染色，200×）

2.3.2瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞免疫組化特點(diǎn)

瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)組在各代次均可穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白，該Ⅱ型膠原蛋白成分不僅出現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)，而且在細(xì)胞周圍也有表達(dá)。見圖6。

圖6　瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白（免疫組化染色，200×）

2.3.3 Western blot驗(yàn)證不同培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原蛋白的能力

通過Western blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，單層貼壁式培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)能力逐代減弱；而瓊脂板-細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)的各代次軟骨細(xì)胞均保持較穩(wěn)定的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。見圖7。

圖7　兩種培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白Western blot檢查

3　討論

體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)是了解軟骨細(xì)胞生物學(xué)性狀的重要方法，有助于研究骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，對(duì)促進(jìn)軟骨組織工程的發(fā)展有重要意義。近年來隨著科技研究的飛速發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)多種方式可體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，并受多種因素影響，如力學(xué)因素、氧濃度因素和體內(nèi)細(xì)胞因子因素等。軟骨細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)始終處于一定的應(yīng)力環(huán)境中，且在體內(nèi)處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)，同時(shí)由體內(nèi)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)如腫瘤壞死因子α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等共同作用生長(zhǎng)。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞受上述因素的影響，會(huì)出現(xiàn)退變現(xiàn)象，一般從第4代后細(xì)胞表現(xiàn)為逐漸變?yōu)樗笮卧鲋的芰ο陆担瑫r(shí)合成和分泌Ⅱ型膠原蛋白的能力也隨之降低，稱之為“去分化”現(xiàn)象［7］。

“去分化”現(xiàn)象已成為限制軟骨細(xì)胞組織工程的瓶頸問題之一。通過體外培養(yǎng)體系中模擬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生理環(huán)境而獲得數(shù)量且具有相對(duì)正常表型的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是解決該問題的有效手段。在該領(lǐng)域內(nèi)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者開發(fā)出多種關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)模式。并且已經(jīng)取得相當(dāng)進(jìn)展［8］。其中，公認(rèn)較為成功的是生物反應(yīng)器培養(yǎng)方法，此外海藻酸鈉凝珠培養(yǎng)也獲得表型較穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞［10-13］。但是上述方法均存在一定的不足，如生物反應(yīng)器購置費(fèi)用高昂、試劑消耗量較大、運(yùn)轉(zhuǎn)成本較高。而在海藻酸鈣凝珠培養(yǎng)體系中，凝珠制備條件不易控制、傳代過程操作繁瑣等諸多因素都在相當(dāng)程度上限制了其廣泛應(yīng)用。本研究旨在探索一種操作相對(duì)簡(jiǎn)便，且能通過模擬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在體環(huán)境，使得次代細(xì)胞保持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型，能夠穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)的單層貼壁式培養(yǎng)方法比較，瓊脂板-軟骨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法可使得細(xì)胞聚集形成軟骨細(xì)胞團(tuán)塊，較為接近軟骨細(xì)胞的生理?xiàng)l件，從而可獲得表型較穩(wěn)定的關(guān)節(jié)軟骨子代細(xì)胞，保持了Ⅱ型膠原蛋白的合成能力，并且在細(xì)胞外形成了含有Ⅱ型膠原蛋白成分的類似于細(xì)胞外基質(zhì)的物質(zhì)。該培養(yǎng)模式通過避免細(xì)胞貼壁而促使軟骨細(xì)胞聚集并擴(kuò)增，用相對(duì)簡(jiǎn)易的方法獲得能穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白的軟骨細(xì)胞，有可能作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞來源。

目前國(guó)內(nèi)外研究已形成共識(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的存在對(duì)于維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表型至關(guān)重要。有研究報(bào)道，軟骨基質(zhì)中的某些成分與關(guān)節(jié)軟骨表面的整合素分子相互結(jié)合，形成整合素介導(dǎo)的細(xì)胞跨膜信號(hào)途徑，進(jìn)而刺激細(xì)胞穩(wěn)定的表達(dá)和分泌Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖等重要分子。另一方面，在生理?xiàng)l件下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表型維持依賴于其自分泌和旁分泌功能，軟骨細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)、接受多種生長(zhǎng)因子調(diào)控等不同機(jī)制對(duì)其生理功能進(jìn)行調(diào)節(jié)［14-18］。

但是在體外培養(yǎng)過程中，為了獲得原代軟骨細(xì)胞而進(jìn)行的多步酶消化過程使得關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞完全從軟骨基質(zhì)上釋放，形成單個(gè)的游離細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)-整合素介導(dǎo)的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)通路結(jié)構(gòu)完全喪失，細(xì)胞自分泌、旁分泌環(huán)境也受到極大影響，進(jìn)而失去了軟骨基質(zhì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生理功能重要調(diào)控作用。

基于上述考慮，在本研究中，通過在培養(yǎng)皿底部預(yù)先鋪制瓊脂板，使得原代軟骨細(xì)胞不能進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，從而在培養(yǎng)液中懸浮并逐漸聚集成細(xì)胞團(tuán)塊，在一定程度上模擬了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生理環(huán)境。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，聚集成團(tuán)塊的次代軟骨細(xì)胞不僅能進(jìn)行數(shù)量上的增殖，更重要的是保持了穩(wěn)定表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白的能力。免疫組化染色顯示懸浮培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，其細(xì)胞漿內(nèi)和細(xì)胞周圍均有Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，并且在細(xì)胞周圍形成類似于細(xì)胞外基質(zhì)的成分。筆者分析，軟骨細(xì)胞相互聚集而形成細(xì)胞團(tuán)塊，使得其表達(dá)的Ⅱ型膠原蛋白有機(jī)會(huì)在細(xì)胞外聚集起來，并且其自分泌的某些細(xì)胞因子不至于隨更換培養(yǎng)液而完全丟失，從而對(duì)維持其生理功能起到積極意義。但因?yàn)檐浌羌?xì)胞聚集的較為緊密，其深部的細(xì)胞難以獲得營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，因此最終獲得的細(xì)胞團(tuán)塊大小有限。本研究中獲得最大細(xì)胞團(tuán)塊直徑約4 mm，到培養(yǎng)的后期團(tuán)塊反而有所縮小，該現(xiàn)象的發(fā)生時(shí)間與生長(zhǎng)曲線的模式基本符合，前人亦有類似報(bào)道［19-22］，因此筆者考慮其原因可能為團(tuán)塊深部細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而發(fā)生凋亡。

本研究不足之處在于，生理?xiàng)l件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接受壓應(yīng)力負(fù)荷調(diào)控，而在作者構(gòu)建的培養(yǎng)體系中，無法對(duì)獲得的軟骨細(xì)胞團(tuán)塊實(shí)施壓力干預(yù)，因此細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)難以實(shí)現(xiàn)。另一方面，生理?xiàng)l件下的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞屬于“多基質(zhì)、少細(xì)胞”的排列模式，具有典型的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)［17-18］，但本實(shí)驗(yàn)所獲得的軟骨細(xì)胞團(tuán)塊特點(diǎn)為細(xì)胞排布緊密，細(xì)胞外基質(zhì)樣成分較少。

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Effect of cell-pellets suspension culture mode preserves the phenotype of rabbit chondrocytes in vitro

LUO QiLIU Kai
Department of Orthopedic，the Second People's Hospital of Baoji City，Shaanxi Province，Baoji721000，China

Objective To explore and build relatively convenience and low-costing culture mode to preferably preserve the phenotype of chondrocytes in vitro which may provide new ideas for establish of cartilage cell bank.Methods Rabbit cartilage cells were collected by a modified three-step digestion method.Traditional mono-layer adherent culture and chondrocyte-pellets suspension culture and passages were proceeded respectively.Growth dynamic characters of both culture systems were determined and compared by flow cytometry technique.Immunohistochemistry and Western bolt were carried out to compare the expression of typeⅡcollagen.Results①Amplification of chondrocytes from rabbit cartilage proved to be faster in mono-layer adherent culture with the loss of its original round shape and became similar to fibrocytes，which was determined as phenotype degeneration.Immunohistochemistry study and Western bolt examination both showed that，the expression of typeⅡcollagen decreased gradually with passages carried out，typeⅡcollagen was barely expressed in the fourth passage.②Chondrocytes increased slower in pellets suspension culture with a growth curve similar to primary cartilage cells.In each passages，cells aggregated and pellets were formed with a largest diameter about 4 mm.TypeⅡcollagen was expressed steady in each passage and extra-cellular matrix was precipitated around chondrocytes.Conclusion Suspension culture mode is relatively close to the physiological conditions of cartilage cells，daughter cells of chondrocyte phenotype is available，which preserves the ability of the stable expression of typeⅡcollagen，and may be served as a choice for cartilage tissue engineering.

Chondrocyte；Dedifferentiation；Suspension culture；Tissue engineering

R332

A

1673-7210（2015）12（b）-0020-06

2015-06-18本文編輯：任念）

羅琦（1971.10-），男，副主任醫(yī)師；研究方向：關(guān)節(jié)外科。