陳佳 王桂艷 張宇

（佳木斯大學，佳木斯 154007）

北京鴨胚胎后腎間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)及鑒定

陳佳 王桂艷 張宇

（佳木斯大學，佳木斯 154007）

建立禽類后腎間充質(zhì)干細胞（Metanephric mesenchymal stem cells，MMSCs）體外培養(yǎng)體系，研究其生物學特性和多向分化潛能。采用酶消化法分離北京鴨胚胎MMSCs，繪制生長曲線，通過免疫熒光和RT-PCR對MMSCs進行鑒定，誘導MMSCs向脂肪細胞和胰島細胞分化。結果表明，鴨胚胎MMSCs具有良好的增殖活力，表達間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）特異性標志物，并誘導分化為脂肪細胞和胰島細胞。北京鴨胚胎MMSCs在體外具有較強的自我更新能力及多向分化潛能，可作為組織工程的種子細胞進行保存。

鴨；后腎間充質(zhì)干細胞；生物學特性；誘導分化

間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能，廣泛存在于骨髓、脂肪、牙周膜、新生兒臍帶和胎盤組織中，目前大部分的研究集中于人和小鼠，關于家禽類胚胎后腎間充質(zhì)干細胞（Metanephric mesenchymal stem cells，MMSCs）的相關研究較少［1］。胚胎發(fā)育過程中，腎臟有3個相互連接、略為重疊的發(fā)育過程，即前腎、中腎和后腎，后腎發(fā)育為永久性的腎臟。后腎發(fā)育過程中，后腎間充質(zhì)干細胞有自我更新及多向分化能力，發(fā)育為所有腎單位及基質(zhì)細胞［2］。對胚胎后腎間充質(zhì)干細胞的研究有助于理解腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展及恢復的病理生理機制，為腎臟組織工程研究提供充足的無免疫原性的腎臟種子細胞［3］。MMSCs在不同誘導條件下可分化為脂肪細胞、成骨細胞、肝樣細胞、上皮細胞和胰島細胞，作為前體細胞使其在組織工程創(chuàng)傷修復、細胞移植、支持造血、基因治療等方面具有廣闊的臨床應用前景［4］。

北京鴨是家養(yǎng)鳥綱雁形目鴨科動物，繁殖能力強，有穩(wěn)定的遺傳特性，是北京地區(qū)特有的優(yōu)良品種，也是制作正宗北京烤鴨唯一的原材料。本研究選取北京鴨為實驗材料，以胚胎后腎間充質(zhì)干細胞為研究對象，從形態(tài)學、細胞增殖、表面標志物以及多向誘導分化潛能等方面進行鑒定，為家禽干細胞研究及畜禽遺傳資源保存提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

北京鴨胚胎由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平實驗基地種禽場提供。

DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、EDTA二鈉鹽（Gibco），胎牛血清（FBS）（Hyclone），多聚甲醛（北京化工廠），兔抗雞Vimentin、CD44單克隆抗體（BIOSS），兔抗雞CD34單克隆抗體（Santa Cruz），EGF、bFGF、HGF、Active A（Peprotech），地塞米松、IBMX、胰島素、DAPI、lV型膠原酶、TritonX-100、β-毓基乙醇、尼克酞胺、L-谷氨酰胺、雙硫腙（Sigma），山羊血清、山羊抗兔FITC標記二抗（北京中杉金橋），Trizol（Invitrogen），反轉錄試劑盒（TaKaRa）。

1.2 方法

1.2.1 MMSCs的分離培養(yǎng)和傳代 取18日齡的北京鴨胚胎，解剖取出后腎，去除輸尿管芽，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）反復沖洗，將組織塊剪碎成1 mm3大小，37℃ 用0.1% IV型膠原酶消化20 min，0.125%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化10 min，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化［5］，過200目篩，1200 r/min離心10 min，加入完全培養(yǎng)基（DMEM/F12，13%FBS，1% 200 mmol/L L-谷氨酰胺），將細胞密度調(diào)整為1 × 106個/ mL，接種到培養(yǎng)皿，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中［6］。細胞匯合至80%時，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗 2次，用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，觀察細胞形態(tài)，有大量細胞收縮變圓發(fā)亮時，用完全培養(yǎng)基終止消化，進行傳代［7］。

1.2.2 繪制生長曲線 取生長狀態(tài)良好的P5、P10和P15代MMSCs，胰酶消化收集細胞，以1.0 ×104個/ mL的細胞密度接種于24孔板，每日隨機選3個孔，計算細胞個數(shù)，取平均值，連續(xù)計數(shù)8 d，繪制生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為細胞密度［8，9］。

1.2.3 MMSCs RT-PCR鑒定 選取P4、P8和P12 代MMSCs，Trizol法提取總RNA，測定總RNA濃度及純度［10］，經(jīng)反轉錄體系合成cDNA［11］，用Primer Premier 5.0軟件進行特異性引物設計（表1），間充質(zhì)干細胞特異性標記基因：Vimentin、CD73、CD44和CD29；造血干細胞特異性標記基因：CD34和CD45；脂肪細胞特異性標記基因：PPAR-γ和LPL；胰島細胞特異性標記基因：PDX-1和Insulin；內(nèi)參基因：GAPDH。PCR產(chǎn)物進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳［12］，紫外透射儀檢測目的基因是否表達，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 RT-PCR反應引物序列表

1.2.4 MMSCs免疫熒光鑒定 細胞匯合至60%時，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，0.25%Triton X-100通透15 min，PBS洗3次，山羊血清封閉1 h［13］。棄掉封閉液，加入一抗：兔抗雞Vimentin、CD44、CD34（1∶100），4℃孵育過夜。PBS洗3次，避光加入FITC標記的山羊抗兔IgG（1∶100），室溫孵育1 h，PBS洗3次，1 μg/mL DAPI 避光染核20 min，PBS洗3次［14］。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 MMSCs向脂肪細胞誘導分化及鑒定 P6代MMSCs匯合至70%時，隨機分為誘導組和對照組，對照組用完全培養(yǎng)基，誘導組用脂肪細胞誘導液（DMEM/F12 +10%FBS+10-6mol/L地塞米松+10 μg/mL胰島素+ 60 μmol/L吲哚美辛+ 0.5 mmol/L 3-1-甲基異丁基黃嘌呤（IBMX）+1%L-谷氨酰胺）［15］，連續(xù)誘導12 d，觀察細胞形態(tài)，油紅O染色［16］。RT-PCR檢測脂肪細胞特異性基因過氧化物酶體增殖因子活化受體-γ（Peroxisome proliferator activatedreceptor -γ，PPAR-γ）和脂蛋白脂酶（Lipoproteinlipase，LPL）的表達［17］。

1.2.6 MMSCs向胰島細胞誘導分化及鑒定 P6代MMSCs匯合至60%時，隨機分為誘導組和對照組。對照組用完全培養(yǎng)基，誘導組用胰島細胞預誘導液（15 ng/mL bFGF+15 ng/mL EGF+2%B27+ DMEM/F12），3 d后換為誘導液（15 ng/mL HGF+30 ng/mL active A+1 mmol/L β-巰基乙醇+10 mmol/L 尼克酰胺+2% B27+ DMEM/F12）［18］。誘導15 d后誘導組和對照組進行雙硫腙染色［19］。RT-PCR檢測胰島細胞特異性基因胰島素（Insulin）和胰島素促進因子-1（Pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）的表達情況［20］。

2 結果

2.1 MMSCs的形態(tài)學觀察和傳代培養(yǎng)

原代細胞接種12 h后完全貼壁，40 h后開始增殖，呈長梭形或紡錘形漩渦狀生長。細胞形態(tài)良好，增殖迅速，傳代所需時間短，有利于傳代培養(yǎng)。MMSCs易被胰酶消化，傳代時可通過控制胰酶消化時間進行純化，P3代后獲得較純的MMSCs，P18代后，細胞顯示衰老跡象（圖1），MMSCs共傳25代。

圖1 北京鴨胚胎MMSCs的形態(tài)學觀察

2.2 MMSCs生長曲線

P5、P10和P15代MMSCs增殖過程經(jīng)歷潛伏期，對數(shù)期，平臺期和衰退期，細胞增殖規(guī)律均呈典型的“S”形（圖2）。

圖2 北京鴨胚胎MMSCs生長曲線

2.3 MMSCs RT-PCR和免疫熒光鑒定

P4、P8和P12代MMSCs通 過RT-PCR鑒 定 Vimentin，CD29，CD44和CD73呈陽性，CD34和CD45為陰性，GAPDH為內(nèi)參基因（圖3）。免疫熒光鑒定MSCs特異性標記物Vimentin和CD44陽性表達，造血干細胞特異性標記物CD34陰性表達（圖4）。

圖3 北京鴨胚胎MMSCs RT-PCR鑒定

2.4 MMSCs向脂肪細胞誘導分化及鑒定

MMSCs經(jīng)3 d誘導后，細胞增殖緩慢，形態(tài)呈扁平狀，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量脂滴，誘導8 d后，肥大細胞中脂滴更加明顯，脂滴數(shù)量隨誘導天數(shù)的增加而增加并由小的脂滴逐漸聚集成大的脂滴，油紅O染色呈陽性，脂滴被染成紅色。對照組形態(tài)無明顯變化，無脂滴出現(xiàn)，油紅O染色呈陰性（圖5）。RT-PCR鑒定誘導組表達PPAR-γ和LPL，對照組不表達PPAR-γ和LPL（圖6）。

圖4 北京鴨胚胎MMSCs免疫熒光鑒定

圖5 MMSCs向脂肪細胞誘導分化的形態(tài)學觀察及油紅O染色

圖6 MMSCs向脂肪細胞誘導分化RT-PCR鑒定

2.5 MMSCs向胰島細胞誘導分化及鑒定

誘導組在無血清的預誘導液中，細胞增殖減慢，形態(tài)無明顯變化，換誘導液后，形態(tài)發(fā)生變化，少量細胞聚團生長，隨誘導時間的延長，細胞團簇數(shù)量逐漸增加、變大且折光性較強。對照組細胞數(shù)量增加，形態(tài)無明顯變化，無聚團現(xiàn)象。誘導處理15 d后，誘導組雙硫腙染色呈陽性，細胞團被染成棕紅色，表明誘導細胞的胞漿中富含鋅離子，符合胰島細胞的特征。對照組雙硫腙染色呈陰性（圖7）。RT-PCR鑒定誘導組表達Insulin和PDX-1，對照組呈陰性表達（圖8）。

圖7 MMSCs向胰島細胞誘導分化的形態(tài)學觀察及雙硫腙染色

圖8 MMSCs向胰島細胞誘導分化RT-PCR鑒定

3 討論

有研究表明低密度接種有利于細胞增殖［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，接種密度過低，細胞增殖緩慢，難以形成集落樣生長，細胞容易老化；接種密度過高，細胞增殖較快，短時間內(nèi)傳代次數(shù)增多，細胞受機械和化學損傷嚴重，容易出現(xiàn)空泡、核收縮現(xiàn)象。所以本試驗低代次以1∶2傳代，高代次以2∶3傳代。胰酶對細胞的傷害性很大，要嚴格控制消化時間，細胞與胰酶充分接觸后，將胰酶吸出來，當細胞變圓回縮時，立刻加入終止液，避免了培養(yǎng)液中殘留的胰酶對細胞的傷害。

MMSCs生長曲線呈典型的“S”形，經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)期、平臺期和衰退期，符合細胞體外生長的一般規(guī)律［22］。傳代培養(yǎng)過程中存在機械和化學損傷，細胞需要有適應和恢復時間，即潛伏期，在這之后，細胞已完全適應新的環(huán)境并進入對數(shù)期。由于細胞密度增大，細胞與細胞之間存在接觸抑制，細胞生長緩慢進入平臺期，隨著接觸抑制逐漸明顯，細胞數(shù)量呈下降趨勢進入衰退期。細胞代次越高，受外部環(huán)境的影響越大，增殖能力逐漸減弱，細胞逐漸老化。

迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)MMSCs特異性標記基因，只能根據(jù)MMSCs的形態(tài)學特征和報道過的MSCs表面標記基因進行鑒定，本實驗選擇免疫熒光和RTPCR檢測MMSCs與MSCs是否具有相似的生物學特性，進而證實分離培養(yǎng)的MMSCs即為后腎來源的間充質(zhì)干細胞。

本研究用地塞米松、胰島素、IBMX和吲哚美辛共同作用誘導MMSCs分化為脂肪細胞。誘導后胞質(zhì)內(nèi)形成大量脂滴，油紅O染色是鑒定脂滴的常用方法。LPL是脂肪分化前期的標記基因，PPAR-γ是脂肪分化中期的標記基因，RT-PCR檢測LPL和PPAR-γ陽性表達，表明MMSCs在適當條件下能夠誘導成脂肪細胞，為脂肪組織工程研究提供種子細胞。

糖尿病的發(fā)病率逐年升高，將MSCs誘導分化為胰島細胞，移植到患者體內(nèi)己經(jīng)成為治療糖尿病的新療法［23］。HGF能促進胰島細胞形成，Activin A能誘導胰島素陽性細胞的分化，尼克酰胺促進細胞分化成熟和聚集，增加胰島細胞數(shù)量，加快胰島細胞團的形成。雙硫腙染色呈陽性，表明細胞團含有豐富的鋅離子，RT-PCR檢測胰島細胞標記基因Insulin和PDX-1呈陽性表達，說明誘導的細胞符合胰島細胞特征，可為胰島細胞移植治療糖尿病提供種子資源。

4 結論

本研究成功建立了北京鴨胚胎后腎間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)體系，通過RT-PCR和免疫熒光鑒定MSCs的特異性標記基因，對MMSCs自我增殖和多向分化潛能進行鑒定，證實分離培養(yǎng)的MMSCs為后腎來源的間充質(zhì)干細胞。

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（責任編輯 李楠）

Isolation，Culture and Identification of Beijing Duck Embryonic Metanephric Mesenchymal Stem Cells

Chen Jia Wang Guiyan Zhang Yu
（University of Jaimusi，Jiamusi 154007）

This study aimed to establish in vitro culture system for the poultry metanephric mesenchymal stem cells（MMSCs）， and study their biological characteristics and multi-directional differentiation potential. Enzyme digestion method was applied to separate Beijing duck embryo MMSCs and to draw the growth curve. MMSCs were identified by immunofluorescence and RT-PCR. MMSCs were induced to differentiate into adipocytes and islet cells. The results showed that MMSCs had solid proliferative activity and could express MSCs specific markers， and be induced to differentiate into adipocytes and islet cells. In summary， Beijing duck embryo MMSCs have a strong self-renewing ability and multi-directional differentiation potential in vitro， and can be saved as seed cells for tissue engineering.

duck；metanephric mesenchymal stem cell；biological characteristics；induced differentiation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.028

2014-10-06

國家自然科學基金項目（31472099 ），國家家養(yǎng)動物種質(zhì)資源平臺項目（2014年）

陳佳，女，碩士研究生，研究方向：藥物化學；E-mail：chenjia321@126.com

王桂艷，女，副教授，研究生導師，研究方向：藥物化學；E-mail：guiyan713@126.com