楊國翠 崔崢 邱高峰

（上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

中華絨螯蟹性腺特異表達(dá)蛋白EsSOX21b-like的原核表達(dá)與抗體制備

楊國翠 崔崢 邱高峰

（上海海洋大學(xué) 省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

Sox（SRY-related HMG-box）基因編碼一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其產(chǎn)物都具有一個HMG基序保守區(qū)。之前我們在中華絨螯蟹分離鑒定了一個只在性腺中特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本EsSox21b-like，為了驗證EsSOX21b-like蛋白是否也在中華絨螯蟹性腺中特異表達(dá)，本研究原核表達(dá)了EsSOX21b-like蛋白，即將EsSox21b-like基因序列克隆到pGEX-2T表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T-EsSox21b-like，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)融合表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為54 kD。利用Ni柱親和純化融合蛋白后免疫家兔，制備了多克隆抗體，Western blotting檢測表明該抗體能特異地識別性腺組織中EsSOX21b-like蛋白，而在其他組織未檢測到其表達(dá)，目的蛋白分子量約為28 kD，在精巢組織中的表達(dá)量比在卵巢中高，該結(jié)果暗示EsSOX21b-like可能在性腺發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用。

中華絨螯蟹；EsSOX21b-like蛋白；原核表達(dá)；抗體制備

Sox（SRY-related HMG-box）基因是一類SRY（sex-determining region of Y chromosome）相關(guān)基因，編碼一系列轉(zhuǎn)錄因子，參與性別決定與分化、骨組織發(fā)育、血細(xì)胞生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、晶狀體發(fā)育等多種早期胚胎發(fā)育過程［1］。SRY基因是哺乳動物雄性性別決定基因，對睪丸的發(fā)育有著決定性的影響，它首先在人類Y染色體上發(fā)現(xiàn)，是Sox基因家族的第一個成員［2］。其產(chǎn)物含有一個HMG盒［3］，能夠與DNA特異性結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。之后研究發(fā)現(xiàn)了許多與SRY相關(guān)的Sox基因，Sox3、Sox5、Sox6、Sox8、Sox9、Sox17等都是參與性別分化的重要基因。Sox9基因雄鼠胚胎精巢中表達(dá)，具有促使精巢支持細(xì)胞分化的作用［4；5］。在小鼠中Sox9基因的缺失導(dǎo)致XY向XX的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象［6］。Sox3是與SRY同源性最高的基因［7］，但是并不直接參與睪丸的分化和發(fā)育，Graves［7］認(rèn)為在雌性中，Sox3表達(dá)，抑制了Sox9的表達(dá)；在雄性中SRY抑制Sox3，Sox9得以表達(dá)，從而決定睪丸的形成。Sox8也是哺乳動物睪丸決定途徑相關(guān)的基因，能夠促進(jìn)Sox9在睪丸形成中的作用。但是，Sox8基因缺陷的小鼠睪丸發(fā)育正常［8］。另外，Sox5、Sox6在小鼠的減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞中表達(dá)，尤其是在精細(xì)胞階段［9］；Sox17則在減數(shù)分裂前的精母細(xì)胞中表達(dá)［10］。

水產(chǎn)動物中也發(fā)現(xiàn)存在Sox基因，參與性別決定與分化過程。虹鱒中Sox24作為轉(zhuǎn)錄因子在卵子發(fā)生過程起作用［11］。黃鱔Sox17在精巢、卵巢和兩性腺中表達(dá)，特別是在卵巢、兩性腺和精巢片層及生精細(xì)胞中含量更高，可以推測Sox17對黃鱔自然性反轉(zhuǎn)過程中的性腺發(fā)育有重要作用［12］。鱸魚在150 d性別分化開始時Sox17在雌雄性腺中均表達(dá)，在250 d能觀察到明顯的性別差異時，雌魚Sox17表達(dá)量明顯高于雄魚，并且其RNA水平與芳香化酶相關(guān)，可能參與卵巢發(fā)育［13］。另外鱸魚中還發(fā)現(xiàn)存在Sox19與卵巢分化相關(guān)［14］。但是在甲殼類動物中Sox基因是否參與性別決定與分化過程目前尚不清楚。

本研究組之前在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）克隆得到只在性腺中特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本EsSox21blike［15］，并在RNA水平分析了Sox基因的組織表達(dá)，結(jié)果顯示EsSox21b-like基因在精巢、卵巢中均有表達(dá)，推測EsSox21b-like可能參與性腺的發(fā)育。為驗證EsSox21b-like基因在蛋白水平的表達(dá)及作用，本研究組構(gòu)建了EsSOX21b-like蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中高效表達(dá)重組蛋白，純化重組蛋白，制備EsSOX21b-like多克隆抗體，并對抗體進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，旨為進(jìn)一步研究中華絨螯蟹性別決定與分化機(jī)制提供強(qiáng)有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、原核表達(dá)載體pGEX-2T為本實驗室保存，Trizol購自Invitrogen。First strand cDNA synthesis kit，Ex-Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa。BamHⅠ和EcoRⅠ購自Promega。PCR純化產(chǎn)物試劑盒、低分子蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker、SDSPAGE各組分購自上海天根生化科技公司。His-select Spin Columns純化試劑盒、His標(biāo)簽抗體購自Sigma。辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG購自艾比瑪特。DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 使用Trizol Reagent提取中華絨螯蟹性腺總RNA，經(jīng)DNaseⅠ處理后，按First strand cDNA synthesis kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA作為模板，擴(kuò)增EsSox21b-like基因。根據(jù)本實驗室已克隆到的中華絨螯蟹EsSox-like基因全長cDNA序列，利用Primer 5軟件設(shè)計特異引物（表1），擴(kuò)增EsSox-like編碼區(qū)序列。同時，該對引物的5'端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，另外，在下游引物緊鄰終止密碼子的3'端引入編碼6個組氨酸核酸序列。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用柱純化回收與pGEX-2T分別進(jìn)行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切（37℃，2 h），酶切產(chǎn)物純化，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆提取質(zhì)粒（天根質(zhì)粒抽提試劑盒），經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定和測序（上海美吉生物），確定插入片段序列正確性。

1.2.2 工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。挑選陽性菌落接種于液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)過夜。次日按1∶100的比例在含有Amp+（終濃度為60 μg/mL）的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD595介于0.4-0.6之間，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體（5 000 r/min，5 min 4℃），用1×PBS重懸菌體，冰浴下超聲波破碎（超聲時間4 s，間歇時間4 s，保護(hù)溫度24℃，總時間90次）。12 000 r/min 4℃離心10 min，沉淀用含8 mol/L尿素的1×PBS重懸，分別取等量的上清和重懸液SDS-PAGE（5%濃縮膠，12%分離膠）電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色過夜，充分脫色后觀察并分析結(jié)果。

表1 構(gòu)建EsSox21b-like原核表達(dá)載體使用的PCR特異引物

1.2.3 Western blotting檢測融合蛋白 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后，使用半干轉(zhuǎn)移膜將重組蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維NC膜上。含10%小牛血清的TTBS室溫封閉1 h，1∶1 000稀釋的His標(biāo)簽單抗為一抗4℃孵育過夜，TTBS洗滌3次，1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔的IgG為二抗，室溫孵育2 h，TTBS緩沖液洗滌3次，去除非特異性結(jié)合，用DAB顯色液（DAB 15 mg、甲醇 5 mL、30%雙氧水15 μL）顯色。

1.2.4 EsSOX21b-like多克隆抗體的制備及檢測 用His-select Spin Columns純化試劑盒純化的重組蛋白經(jīng)弗氏佐劑乳化后免疫2只成年健康的大白兔。初次免疫后，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，第5次免疫后8 d處死兔子。取全血分離血清，抗原親和純化血清。1.2.5 組織蛋白的提取以及抗血清的檢測 分別取50 mg精巢、卵巢、心臟、肝胰腺、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)和鰓組織與2 mL離心管中，加入1 mL組織蛋白抽提液（博士德），于冰上充分勻漿后4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，適度稀釋的EsSOX21b-like多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western檢測。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以中華絨螯蟹性腺cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳得到一條約800 bp的條帶，與目的片段大小基本一致。將其克隆至原核表達(dá)載體pGEX-2T中，得到重組質(zhì)粒。BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳（圖1）顯示在800 bp處有條帶。同時測序結(jié)果也顯示，克隆得到的序列與EsSox21b-like ORF一致，并且在其終止密碼子前成功的引入了編碼6個組氨酸的核酸密碼子序列。將重組質(zhì)粒命名為pGEX-2T-EsSox21b-like。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-EsSox21b-like雙酶切圖

2.2 重組蛋白的表達(dá)及檢測

重組質(zhì)粒pGEX-2T-EsSox21b-like轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎，離心分離沉淀與上清，SDS-PAGE電泳分析。與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌相比，誘導(dǎo)組的沉淀中有一條明顯加粗的條帶（圖2，箭頭），分子量約54 kD，這與EsSox21b-like基因編碼的蛋白分子量（28 kD）和pGEX-2T上攜帶的GST標(biāo)簽蛋白（圖2，箭頭）分子量（26.3 kD）總和相當(dāng)。在分離的上清中則未檢出相應(yīng)的條帶。

為了證實重組蛋白的表達(dá)，使用His標(biāo)簽抗體做為一抗進(jìn)行Western blotting分析，免疫檢測發(fā)現(xiàn)在54 kD處有特異性條帶（圖3）。說明經(jīng)過誘導(dǎo)后能成功的獲得融合蛋白，且該融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

圖2 pGEX-2T-EsSox21b-like融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE檢測

圖3 His抗體檢測EsSOX21b-like重組蛋白的Western blotting分析

2.3 EsSOX21b-like抗體的制備與免疫鑒定

純化后的重組蛋白分5次注射免疫2只家兔，制備EsSO21b-like多克隆抗體。第5次免疫后采血，抗血清用包被有重組EsSOX21b-like蛋白的酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)，每孔用100 μL濃度為1 μg/mL的抗原包被，用酶標(biāo)儀讀取450 nm下的光吸收值，吸光度（OD值），結(jié)果（表2）顯示2只兔在第5次免疫后，其血清分別在1∶8 000和1∶16 000的稀釋度下，OD值大于1.000，說明制備的多抗效價高。

使用制備的EsSOX21b-like多抗檢測EsSOX21blike蛋白的組織分布情況。Western blotting結(jié)果（圖4）顯示中華絨螯蟹精巢、卵巢的蛋白提取物中能夠檢測到特異性條帶，且該特異性條帶所對應(yīng)的蛋白分子量與軟件預(yù)測的EsSOX21b-like蛋白分子量（28 kD）大小相等。而心臟、肝胰腺、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)和鰓組織總蛋白中則不能檢測到特異性條帶。該結(jié)果說明制備的EsSOX21b-like多克隆抗體能有效的與目的蛋白結(jié)合，EsSOX21b-like蛋白在性腺組織中特異表達(dá)，并且在精巢組織中表達(dá)量高于卵巢。

圖4 EsSOX21b-like 抗體檢測不同組織總蛋白

表2 ELISA法檢測抗體效價

3 討論

本研究通過IPTG誘導(dǎo)、超聲波破碎工程菌，在沉淀中檢測到融合表達(dá)的目的蛋白，并且用Hisselect Spin Columns純化獲得的融合蛋白能夠有效地免疫家兔獲得效價高、特異性強(qiáng)的EsSOX21b-like蛋白的多克隆抗體。相反，在離心后的上清液中沒有檢測到可溶性的融合蛋白，說明表達(dá)的蛋白以包涵體形式存在。與具有活性的可溶性蛋白相比包涵體蛋白具有相同的一級結(jié)構(gòu)，不影響抗體制備，只是由于肽鏈無法正確折疊形成二、三級結(jié)構(gòu)而不具有生物活性［16］。包涵體蛋白經(jīng)過變性、洗滌、復(fù)性、純化等一系列處理過程最終可以轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘鞍祝?7］。之前許多研究表明，原核表達(dá)也可以獲得有活性的可溶蛋白［18-21］，其中IPTG的誘導(dǎo)至關(guān)重要，可以通過減少IPTG的誘導(dǎo)量和誘導(dǎo)時間控制目的蛋白表達(dá)量，避免包涵體的形成；溫度對蛋白的可溶性也有很大的影響，如范丙友［21］通過降低溫度等成功獲得了可溶性的香豆酸：輔酶A連接酶。除此之外，以大腸桿菌為宿主細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)時，還可以在培養(yǎng)基中加入一些能促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑，如高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖（阻止分泌到周質(zhì)的蛋白質(zhì)聚集反應(yīng)）、乙醇（誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)）、低分子質(zhì)量的巰基或二硫化合物（影響細(xì)胞周質(zhì)的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaC1等來增加融合蛋白的溶解度［22］。后續(xù)我們擬采用以上各種實驗方法進(jìn)行直接誘導(dǎo)表達(dá)以其獲得具有活性的目的蛋白，為研究EsSOX21b-like 蛋白生物學(xué)功能奠定必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)。

Sox21基因是SoxB基因亞族中的重要一員，在脊椎動物與無脊椎動物中均有發(fā)現(xiàn)。在小鼠，Sox21在未成熟神經(jīng)系統(tǒng)腦室區(qū)表達(dá)，而在成熟腦內(nèi)其表達(dá)則限制在腦室下區(qū)，進(jìn)一步的研究證實Sox21在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程能抑制神經(jīng)元分化［23］。另外，Sox21在小鼠的耳蝸中也有表達(dá)，且Sox21缺陷型小鼠表現(xiàn)出輕度聽力障礙［24］。在斑馬魚，Sox21存在Sox21a與Sox21b兩種亞型，Sox21a在腦、皮膚、腸及卵巢中表達(dá)，而Sox21b除了影響性腺的正常發(fā)育外對晶狀體的正常發(fā)育也會起到一定的調(diào)控作用［25，26］。Sox21b基因在蜂王卵巢管中的滋養(yǎng)細(xì)胞及其卵子中也有較強(qiáng)表達(dá)，在蜜蜂卵巢發(fā)育及成熟過程中發(fā)揮其功能［27］。蜜蜂在分類系統(tǒng)上與中華絨螯蟹同屬于節(jié)肢動物門，其親緣關(guān)系更加緊密，故彼此相同的基因在表達(dá)特征與功能上應(yīng)該相近或相同。之前我們的研究結(jié)果表明，中華絨螯蟹EsSox21blike基因的mRNA僅局限在精巢和卵巢表達(dá)，暗示在精子的發(fā)生及卵細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。本研究在蛋白水平進(jìn)一步證明EsSOX21b-like在性腺中特異表達(dá)，且在精巢組織中表達(dá)量明顯高于卵巢，推測該蛋白可能是精巢發(fā)育必不可少的因子。

4 結(jié)論

本研究以中華絨螯蟹性腺為模板，設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增EsSox21b-like的開放閱讀框，克隆至pGEX-2T表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)EsSOX21blike重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，EsSOX21b-like重組蛋白主要以包涵體形式存在。大量表達(dá)重組蛋白，親和層析純化后免疫家兔，得到高效價的多克隆抗體。Western blotting檢測中華絨螯蟹不同組織EsSOX21b-like蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示EsSOX21blike蛋白在性腺中特異表達(dá)，尤其在精巢中表達(dá)量高，而在其他組織中不表達(dá)，推測EsSOX21b-like在性腺發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression，Antibody Preparation of Gonad-specific Protein EsSOX21b-like of the Chinese Mitten Crab Eriocheir sinensis

Yang Guocui Cui Zheng Qiu Gaofeng
（Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization Certificated by Ministry of Agriculture and Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

The Sox（SRY-related HMG-box）is a large family of genes which encode transcription factors with high-mobility-group DNA binding domain related to the SRY（sex determining region Y）. In previous studies we isolated and identified EsSox21b-like transcripts exclusively expressed only in gonads of the Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）， this study is to verify whether EsSOX21b-like protein is also specifically expressed in the gonad. Gene EsSox21b-like was cloned to expression vector pGEX-2T， the recombinant prokaryotic expression plasmid pGEX-2T-EsSox21b-like was constructed， then transferred into host Escherichia coli BL21， and induced by IPTG. SDS-PAGE analysis revealed that the fusion protein was expressed as inclusion body with the molecular weight of 54 kD. The recombinant proteins were subsequently purified by Ni+affinity chromatography. Then the purified protein was used to immunize rabbits for preparation of the EsSOX21b-like antibody. Western blotting detection showed the antibody specifically recognized the EsSOX21b-like protein in the gonad， with molecular weight of 28 kD，whereas no expression was detected in other tissues. The expression level of the target protein was much higher in testis than that in ovary. This result implied that the EsSOX21b-like protein could have a regulatory role in the gonad development.

Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）；EsSOX21b-like protein；prokaryotic expression；antibody preparation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.030

2014-09-16

國家自然科學(xué)基金項目（31272655），國家科技支撐計劃項目（2012BAD26B04），上海市科委重點基礎(chǔ)科研基金項目（11JC140 4600），上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目（B5005120001）

楊國翠，女，碩士研究生，研究方向：中華絨螯蟹生殖與發(fā)育；E-mail：554025117@qq.com

邱高峰，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：蝦蟹分子遺傳與繁殖；E-mail：gfqiu@shou.edu.cn