李皓洋胡小元易詠竹楊鑫張志芳李軼女

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，鎮(zhèn)江 212018）

犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗病毒活性的測定

李皓洋1胡小元1易詠竹2楊鑫1張志芳1李軼女1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，鎮(zhèn)江 212018）

犬α干擾素（CaIFNα）在犬病防治過程中應(yīng)用廣泛。旨在開發(fā)一種高效的CaIFNα表達(dá)方法。首先按家蠶密碼子的偏好性對GenBank中的一個(gè)CaIFNα基因進(jìn)行了優(yōu)化與合成，將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393中，并與親本病毒BmBacmid共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組。得到的重組病毒用于感染家蠶幼蟲，收集發(fā)病幼蟲的蠶血淋巴用于CaIFNα檢測。采用細(xì)胞病變抑制法在MDCK-VSV*GFP系統(tǒng)中測定其抗病毒活性。結(jié)果顯示家蠶表達(dá)的CaIFNα能有效抑制VSV*GFP在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，其抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

犬α干擾素；家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；抗病毒活性檢測

干擾素（Interferon，IFN）是一類具有抗病毒活|性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和免疫調(diào)節(jié)作用等多種生理活性的細(xì)胞因子，在自然免疫以及適應(yīng)免疫中都發(fā)揮著重要作用。IFN于1957年由Isasscs等［1］在進(jìn)行流感病毒感染雞胚的實(shí)驗(yàn)中首先發(fā)現(xiàn)，隨后逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。IFN因其抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲等功效［2-4］，一直被當(dāng)作一種廣譜性治療藥物使用。而天然干擾素的含量非常稀少，而且提取純化的成本高昂，極大地制約了其廣泛應(yīng)用。因此，應(yīng)用基因工程手段表達(dá)高活性的干擾素產(chǎn)品，一直以來都是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。

隨著我國犬飼養(yǎng)量逐年升高，隨之而來的疾病問題也日趨嚴(yán)重?？袢?、犬細(xì)小、犬瘟熱等病毒性疾病已經(jīng)成為制約犬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的主要疾病，并且時(shí)常引起人類感染，嚴(yán)重威脅人類健康和社會(huì)安全。CaIFN在多種犬病毒性疾病的防治過程中發(fā)揮了重要作用。CaIFN的研究開始于20世紀(jì)80年代，Himmler等［5］用人IFNα的探針從犬基因組中克隆出了CaIFNα的基因，并利用大腸桿菌對CaIFNα進(jìn)行了原核表達(dá)，最后得到了抗病毒活性為3×105U/L的CaIFNα產(chǎn)物。這是對CaIFN研究的首次報(bào)道。1992年Devos等［6］用鼠的IFNγ探針從犬基因組中克隆出了CaIFNγ基因，并成功將CaIFNγ在中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）中進(jìn)行了表達(dá)，得到了有抗病毒活性的CaIFNγ產(chǎn)物。之后，人們又利用基因工程手段在多種表達(dá)體系中對犬干擾素進(jìn)行了表達(dá)，并且取得了一系列的表達(dá)產(chǎn)品用于犬類疾病的預(yù)防和治療［7，8］。

CaIFN在多種犬類疾病的預(yù)防和治療過程中都發(fā)揮著重要作用。王紅等［9］給患病毒性腸炎的實(shí)驗(yàn)組病犬注射CaIFNα發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病癥狀明顯減輕，并且癥狀持續(xù)時(shí)間明顯縮短，說明CaIFNα在犬病毒性腸炎的治愈過程中發(fā)揮了重要作用。王忠海等［10］將CaIFN用作人用狂犬疫苗的佐劑，注射小鼠后發(fā)現(xiàn)CaIFN能誘導(dǎo)中和抗體更早、更多的產(chǎn)生，說明CaIFN在疫苗制備方面有極大的應(yīng)用潛力。與CaIFN的巨大應(yīng)用潛力相比，目前市場中的CaIFN制劑的供應(yīng)量卻略顯不足，一些犬類疾病，如犬過敏性皮膚炎［11］等仍用貓干擾素進(jìn)行治療。因此，簡單、高效、安全的CaIFN表達(dá)方法的研究具有重要價(jià)值。

CaIFNα是治療犬病毒病的主要藥物，其主要作用原理是通過增加MHCⅠ類分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對其靶細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)增加自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的裂解潛能，使機(jī)體能有效地抵御外源病毒的感染［12］。利用基因工程手段表達(dá)CaIFNα具有可觀的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。本研究將CaIFNα在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并在犬細(xì)胞系中檢測其抗病毒活性，以期開發(fā)一種高效的CaIFNα表達(dá)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態(tài)Trans I由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。載體構(gòu)建過程中用到的限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（TC-100）購自AppliChem公司。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖DMEM），胎牛血清（FBS）購自Gibco公司。CaIFNα基因由南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393、犬腎細(xì)胞（MDCK）、家蠶細(xì)胞（Bm-N）、ORF1629缺損的親本桿狀病毒BmBacmid（專利號(hào)：201110142492.4）和表達(dá)綠色熒光蛋白的水皰性口炎病毒（VSV *GFP）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 CaIFNα基因的優(yōu)化和合成 本研究選取GenBank中的一條CaIFNα基因序列（HQ680864.1），根據(jù)家蠶的密碼子偏好性對基因核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化改造，在不改變蛋白序列的前提下，優(yōu)化處理了可能影響蛋白表達(dá)與折疊的因素，如GC含量、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等，以提高CaIFNα基因在家蠶體內(nèi)的表達(dá)效率。在優(yōu)化好的CaIFNα基因序列起始密碼子前添加了Kozak序列，以提高CaIFNα在真核表達(dá)體系中的表達(dá)效率。此外，為了方便后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)，在CaIFNα的5'末端和3'末端分別添加了的BamHⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)。CaIFNα序列由南京金斯瑞公司優(yōu)化合成，并連接到pUC57載體上，形成pUC57-CaIFNα。

1.2.2 轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的構(gòu)建 將pUC57-CaIFNα進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理，回收目的基因CaIFNα片段。將得到的CaIFNα與同樣用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接，連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans I。挑取單菌落提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定，選取含有目的基因的質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致的質(zhì)粒命名為pVL-CaIFNα。

1.2.3 重組病毒的共轉(zhuǎn)染及篩選 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pVL-CaIFNα與線性化的親本病毒DNA共轉(zhuǎn)染Bm-N細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組［13］。共轉(zhuǎn)染后將Bm-N細(xì)胞置于27℃環(huán)境中培養(yǎng)6 h，棄上清，補(bǔ)加含10% FBS的TC-100培養(yǎng)基，在27℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察約4-5 d，待細(xì)胞病變浮起后，收集上清液，得到重組病毒。將重組病毒液按105pfu/頭的劑量接種五齡起蠶，待家蠶發(fā)病后，收集蠶血淋巴，得到家蠶表達(dá)產(chǎn)物，-20℃保存。

1.2.4 CaIFNα抗病毒活性的鑒定 采用細(xì)胞病變抑制法［14］，利用MDCK-VSV*GFP系統(tǒng)檢測家蠶表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性。樣品以10倍稀釋度做梯度稀釋，共5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)。每個(gè)細(xì)胞孔加入處理后的樣品100 μL，攻毒100TCID50。同時(shí)設(shè)置病毒對照組（只加病毒不加干擾素）和空白對照組（不加病毒和干擾素）。攻毒24 h后，觀察細(xì)胞病變情況，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)量來評(píng)估細(xì)胞的病變水平。

2 結(jié)果

2.1 合成質(zhì)粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

對南京金斯瑞公司優(yōu)化合成的pUC57-CaIFNα質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)電泳分離后，出現(xiàn)了一條大小約為600 bp的條帶（圖1）。CaIFNα的基因?yàn)?64 bp，預(yù)期結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)測序分析表明CaIFNα序列合成無誤，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖1 合成質(zhì)粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

目的基因CaIFNα片段與經(jīng)雙酶切pVL1393載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取單菌落提取質(zhì)粒后，用BamHⅠ和XbaⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)電泳分離后，出現(xiàn)于預(yù)期結(jié)果大小相似的目的條帶（圖2）。將含有目的條帶的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序分析表明CaIFNα已正確連接到pVL-1393中。

圖2 重組轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

2.3 CaIFNα抗病毒活性檢測

利用細(xì)胞病變抑制法測定表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性，攻毒大約24 h后，觀察到空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)正常，無熒光出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組加入高濃度干擾素的細(xì)胞孔病毒復(fù)制被完全抑制，無熒光（圖3-A），當(dāng)干擾素稀釋到105倍時(shí)，部分細(xì)胞孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，但病變程度仍明顯小于病毒對照組，說明該稀釋度下干擾素已無法完全抑制病毒復(fù)制，但仍有明顯的抑制作用（圖3-B），病毒對照組所有細(xì)胞孔都出現(xiàn)熒光（圖3-C）。出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞孔即記為細(xì)胞病變，記錄細(xì)胞病變情況（表1），統(tǒng)計(jì)病變孔與非病變孔的個(gè)數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算干擾素的效價(jià)。選取多次重復(fù)測定結(jié)果中的較有代表性的一次數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析，計(jì)算其效價(jià)至少可達(dá)1.78×106U/mL。

3 討論

隨著養(yǎng)犬業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，犬類疾病對人類健康的影響也越來越嚴(yán)重。CaIFNα作為一種具有廣譜抗病毒、細(xì)菌和寄生蟲活性的生物制劑，在犬類疾病的預(yù)防與治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。CaIFNα的高效表達(dá)一直是生命科學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，目前，CaIFNα已在多種表達(dá)體系內(nèi)得到表達(dá)。隨著外源蛋白表達(dá)技術(shù)越來越成熟，如何進(jìn)一步簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高外源蛋白的生物活性將是今后蛋白表達(dá)技術(shù)發(fā)展的方向。

圖3 利用MDCK/VSV*GFP 系統(tǒng)檢測家蠶表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性

表1 家蠶表達(dá)的CaIFNα抗病毒活性檢測

大腸桿菌作為一種傳統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)工具，因其遺傳背景清楚、培養(yǎng)周期短、目的基因表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)一直被廣泛使用。殷玉和等［15］合成了編碼CaIFNα的基因片段，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后利用MDCK-VSV系統(tǒng)進(jìn)行了檢測，測定純化后CaIFNα蛋白的比活為3×107U/mg。畢赤酵母作為一種真核表達(dá)工具，具有翻譯后修飾的功能，能使表達(dá)的外源蛋白正常的進(jìn)行糖基化等修飾，有利于提高外源蛋白的活性，因此也常被用于干擾素的表達(dá)。王玉等［16］將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的CaIFNα基因在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)，得到最高活性為1.58 × 108U/mg的CaIFNα產(chǎn)品。但外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)常形成包涵體，不具備有效的生物活性，要獲得具有活性的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過變性復(fù)性等一系列過程，操作復(fù)雜且成本高昂；在畢赤酵母中的表達(dá)也面臨復(fù)雜的純化過程，這不可避免地增加了干擾素的生產(chǎn)工序和生產(chǎn)成本。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種優(yōu)秀的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有高安全性，高表達(dá)量和良好的外源蛋白翻譯后加工修飾功能等優(yōu)點(diǎn)，在高活性真核蛋白表達(dá)過程中被廣泛采用［17］。故本研究選用家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行CaIFNα的表達(dá)。

由于不同物種中密碼子的使用存在偏好性，因此采用PCR法直接克隆的功能蛋白的DNA序列，在異源宿主體內(nèi)表達(dá)時(shí)經(jīng)常面臨蛋白表達(dá)量低，活性差等一系列問題。密碼子偏好性優(yōu)化是提高異源蛋白表達(dá)量的有效手段［18］。Zhou等［19］在利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)牛乳頭瘤病毒的衣殼蛋白時(shí)，通過密碼子優(yōu)化，使表達(dá)量提高了1 000多倍。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)NCBI中的CaIFN-α基因序列，按家蠶密碼子偏好性對其進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，在優(yōu)化過程中去除了mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列等不利于蛋白表達(dá)的因素，然后采取化學(xué)合成法合成用于表達(dá)的完整的CaIFNα序列，以期使CaIFNα在家蠶細(xì)胞內(nèi)得到良好表達(dá)。

在進(jìn)行CaIFNα抗病毒活性測定時(shí)，本研究采用了重組VSV*GFP病毒，該病毒感染細(xì)胞后可以在細(xì)胞中復(fù)制，并產(chǎn)生綠色熒光蛋白，通過觀察熒光的有無即可確定細(xì)胞是否被病毒感染［20］。有效避免了用普通VSV測定干擾素活性時(shí)細(xì)胞病變不明顯，觀察結(jié)果偏差大的問題，大大提高了檢測的靈敏度與結(jié)果的可靠性。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測得家蠶表達(dá)的CaIFNα抗病毒活性基本穩(wěn)定，抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

4 結(jié)論

本研究對犬α干擾素基因進(jìn)行合理的優(yōu)化設(shè)計(jì)，并成功表達(dá)出具有良好抗病毒活性的CaIFNα，每毫升蠶血淋巴中CaIFNα的抗病毒活性不低于1.78×106U，為低成本、高活性的CaIFNα生物制劑的高效制備提供了一種有效途徑。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression of Canine Interferon Alpha in Silkworm-baculovirus Expression System and the Antiviral Activity Assay

Li Haoyang1Hu Xiaoyuan1Yi Yongzhu2Yang Xin1Zhang Zhifang1Li Yinü1
（1. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2. The Sericultural Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang 212018）

Canine interferon alpha（CaIFNα）was widely used in the prophylaxis and cure of canine diseases. The purpose of this study is to develop an efficient method to express CaIFNα. A canine interferon alpha gene in GenBank was optimized according to the codon bias of silkworm and synthesized， and then cloned into the baculovirus transfer vector pVL1393 to construct the recombinant plasmid pVL-CaIFNα. The pVL-CaIFNα was co-transfected with the BmBacmid DNA into silkworm cells and after in vivo recombination. The recombinant virus was gathered and used to infect silkworm larvae. The hemolymph of infected larvae was collected for antiviral activity assay. The antiviral activity of expressed CaIFNα was examined on Madin-Darby canine kidney cells infected with the vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein（VSV*GFP）. The result showed that CaIFNα expressed in silkworm can inhibit the multiplication of VSV*GFP and the antiviral activity was about 1.78×106U/mL.

canine interferon alpha；silkworm-baculovirus expression system；antiviral activity assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.022

2015-03-17

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”計(jì)劃（2011AA100603），國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”計(jì)劃（2012CB114600）

李皓洋，男，碩士，研究方向：昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；E-mail：815579279@qq.com

李軼女，女，博士，副研究員，研究方向桿：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；E-mail：liyinv@caas.cn