張娜 劉驍

（湛江出入境檢驗檢疫局 廣東湛江 524000）

對蝦白斑綜合征病毒表面抗原基因免疫保護性的研究

張娜 劉驍

（湛江出入境檢驗檢疫局 廣東湛江 524000）

將對蝦白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的VP19、VP28基因融合克隆入pVAX1.0真核表達載體制備成多價DNA疫苗，并用構(gòu)建的DNA疫苗制備成飼料免疫實驗對蝦，用RT-PCR檢測DNA疫苗在對蝦體內(nèi)的表達，同時比較構(gòu)建的多價DNA疫苗與VP19、VP28單價DNA疫苗對抗WSSV的保護率。結(jié)果顯示構(gòu)建的DNA疫苗有抗WSSV免疫保護性，且pVAX1.0-VP19-VP28多價DNA疫苗保護率高于單價疫苗。

南美白對蝦；白斑綜合征病毒；表面抗原；免疫活性

1 前言

南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）是當今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一，隨著養(yǎng)殖量的大量增加、養(yǎng)殖品種的日益增多和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種對蝦疫病也日益增多，特別是病毒病已成為阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。白斑綜合征（White Spot Syndrome）是對養(yǎng)殖對蝦危害最大的病毒性疾病之一［1］，其具有致病性強、危害性大、地域分布和宿主范圍廣泛等特點，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）、聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）及亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡中心（NACA）規(guī)定需要報告的重要水生動物疾病。自1993年首次暴發(fā)性流行以來，至今已造成巨大的經(jīng)濟損失，同時也給海洋生態(tài)平衡帶來了很大的威脅。

近年的研究表明，對蝦存在類免疫機制，盡管不能夠產(chǎn)生抗體，沒有免疫記憶，但先天性免疫系統(tǒng)同樣能在被感染后產(chǎn)生有效而快速的免疫反應，從而有效保護它們免受微生物的侵襲［2］。

本研究利用分子生物學技術(shù)將對蝦白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的VP28、VP19基因串聯(lián)克隆為融合基因，再克隆至pVAX1.0真核表達載體，制備多價基因DNA疫苗，并檢測疫苗在對蝦體內(nèi)的表達情況和抗WSSV的保護效果，為對蝦抗WSSV DNA疫苗的進一步研究奠定了基礎。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1實驗動物

南美白對蝦喂養(yǎng)在長100cm、高50cm、寬30cm的水槽中，用不含有任合抗病毒藥物的飼料飼養(yǎng)7d以上備用，隨機挑取3尾蝦用PCR方法進行病毒排除檢測。

2.1.2質(zhì)粒與菌株

pMD18-T載體：大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司產(chǎn)品；pET-28a（+）質(zhì)粒、pVAX1.0載體質(zhì)粒：本實驗室購買；大腸桿菌BL21：本實驗室保存。

2.1.3工具酶與主要試劑

rTaq酶、DL2000Marker、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4-DNA連接酶、膠回收試劑盒：均購自大連寶生物（TaKaRa）公司。

2.1.4主要儀器設備

PCR擴增儀（PC48HY-8）：德國Biometra公司；凝膠成像儀（BAD Digital）：德國Biometra公司；高速冷凍離心機：Eppendorf centrifuge 5417R，轉(zhuǎn)速≥13000rpm；電泳儀（DYY-8C）：北京市六一儀器廠。

2.2方法

2.2.1設計WSSV VP19和VP28擴增引物

依據(jù)GenBank上發(fā)表的VP19、VP28基因序列，設計引物。VP19上游引物：5-GGATCCATGGCCACC ACGACTAACAC-3（劃線處為BamH酶切位點）；下游引物：5-GAATTCTTACTGCCTC CTCTTGGGGT-3（劃線處為EcoRⅠ酶切位點）。VP28上游引物：5-AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC-3（劃線處為EcoRⅠ酶切位點）；下游引物：5-CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC-3（劃線處為XhoⅠ酶切位點）。

2.2.2WSSV VP19和VP28基因的PCR擴增

使用QIAGEN試劑盒提取病料蝦組織DNA。PCR反應體系為：10×buffer 2.5 μL，引物（40 pmol）各1.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶0.5 μL，模板4 μL，加水至25 μL。反應程序：94℃4min，94℃1min，55℃1 min，72℃2 min；32循環(huán)，72℃10 min。

2.2.3WSSV VP19基因和VP28基因片段的克隆與序列分析

將PCR產(chǎn)物目的條帶進行回收和純化，分別與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化受體菌E.coli DH5a進行克隆，分別進行酶切鑒定；送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，分別與GenBank進行同源性分析。

2.2.4DNA疫苗pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28的構(gòu)建

BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切pMD-18-T-VP19和pVAX1.0，EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切pMD18-T-VP28和pVAX1.0，分別回收VP19、pVAX1.0片段和VP28、pVAX1.0片段連接構(gòu)建pVAX1.0-VP19和pVAX1.0-VP28重組質(zhì)粒。

2.2.5多價DNA疫苗pVAX1.0-VP19-VP28的構(gòu)建

重新設計VP19引物（上游含有BamHⅠ酶切位點，下游含有EcoRⅠ酶切位點，去除終止密碼子），以pMD18-T-VP19為模板，PCR擴增VP19-2基因，將它克隆到pMD18-T載體，記為pMD18-TVP192。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pMD18-TVP192和pVAX1.0，回收各片段，連接構(gòu)建pVAX1.0-VP192質(zhì)粒；用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pVAX1.0-VP192和pMD18-T-VP28，連接構(gòu)建pVAX1.0-VP19-VP28質(zhì)粒。

2.2.6DNA疫苗在蝦體內(nèi)表達情況的檢測

取3個構(gòu)建好的重組質(zhì)粒保存的菌種分別進行培養(yǎng)得到菌液，將得到的菌液3L 6000g離心10min，得到菌體；以反復凍融法滅活菌體，拌入飼料中，包裹蛋清，陰干，分裝。試驗分為4組，分別為3組疫苗組和1組空白對照組，每組10尾蝦，分別在免疫10 d和20 d取3尾蝦蝦鰓，用RT-PCR法分別擴增VP28和VP19基因。

2.2.7多價DNA疫苗免疫保護性實驗

試驗共分為5組，每組20尾蝦，隨機分組，淘汰體重過低或過高的蝦，平均體重約10±0.5 g。各組分別為非感染非免疫對照組、感染非免疫對照組、pVAX1.0-VP19組、pVAX1.0-VP28組、pVAX1.0-VP19-VP28組。分別投喂制備的各組餌料，每日3次，每次4 g。在飼料投喂20 d后，每只蝦分別口服1 mL病毒液（經(jīng)對蝦傳代3次的WSSV［3］，經(jīng)過病毒收集）進行WSSV攻毒，每天觀察蝦的情況。相對保護率（%）=（1-實驗組死亡率/對照組死亡率）×100%。

3 結(jié)果

3.1VP19基因、VP28基因PCR擴增結(jié)果

以病料蝦組織DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示約375 bp和633 bp的特異性目的條帶，與預計大小一致（見圖1）。

圖1　VP19基因、VP28基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳分析

3.2VP19基因和VP28基因片段克隆酶切鑒定

VP19基因和VP28基因PCR產(chǎn)物分別連接PMD18-T克隆載體，經(jīng)雙酶切后，結(jié)果顯示片斷與預計大小一致（見圖2）。所得VP19基因序列開放閱讀框長375 bp，與GenBank：DQ681071.1核苷酸同源性99.2%，氨基酸同源性100%；所得VP28基因序列開放閱讀框長633 bp，與GenBank：DQ979320.1核苷酸同源性100%，氨基酸同源性100%。

圖2　PMD18-T-VP19、PMD18-T-VP28重組質(zhì)粒、雙酶切鑒定

3.3DNA疫苗pVAX1.0-VP19、pVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28的構(gòu)建

用內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ分別雙酶切構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，電泳顯示大小分別與VP19基因、VP28基因相一致的DNA片段（見圖3）。

圖3　PVAX1.0-VP19、PVAX1.0-VP28、pVAX1.0-VP19-VP28質(zhì)粒雙酶切鑒定

3.4DNA疫苗在蝦體內(nèi)表達情況的檢測

構(gòu)建的3組重組質(zhì)粒分別免疫對蝦，用RTPCR法分別擴增出與VP28基因和VP19基因條帶，非免疫組未能檢測到。結(jié)果表明VP19、VP28基因重組質(zhì)粒和與兩個基因融合的重組質(zhì)粒均能在口服免疫的對蝦蝦鰓中轉(zhuǎn)錄出mRNA（見圖4）。

圖4　RT-PCR法檢測DNA疫苗在對蝦體內(nèi)的表達

3.5DNA疫苗免疫南美白對蝦后抗WSSV的相對保護率

DNA疫苗免疫南美白對蝦后抗WSSV的試驗結(jié)果見表1。

表1　DNA疫苗免疫南美白對蝦后抗WSSV的死亡率和相對保護率

結(jié)果顯示：非感染非免疫對照組對蝦無死亡，感染非免疫對照組死亡率為80%；pVAX1.0-VP19組死亡率為60%，相對保護率為25%；pVAX1.0-VP28組死亡率為55%，相對保護率為31.25%；pVAX1.0-VP19-VP28組死亡率為45%，相對保護率為43.75%。結(jié)果還顯示：對蝦在口服疫苗免疫后攻毒第5天出現(xiàn)高死亡率，在第8天死亡趨于穩(wěn)定；pVAX1.0-VP19-VP28疫苗組死亡率低于pVAX1.0-VP19組和pVAX1.0-VP28組。

經(jīng)過統(tǒng)計學方差分析，各組間差異均非常顯著（P＜0.05）。

4 討論

目前為止，國內(nèi)還沒有生產(chǎn)南美白對蝦SPF種苗，所以對蝦養(yǎng)殖企業(yè)主要依賴從國外引進原種。隨著對蝦養(yǎng)殖量的增加，每年種蝦需求也在不斷增加。在進境親蝦的檢驗檢疫工作中發(fā)現(xiàn)，進境南美白對蝦（親蝦）具有抗病不穩(wěn)定遺傳的特征，育成的第一代商品蝦苗具有良好的抗病能力，但是第二代蝦苗抗病能力差，蝦苗大小不一，質(zhì)量下降。所以企業(yè)在一代商品苗后需要重新引進種苗，此項技術(shù)壁壘給我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟壓力。因此，從免疫抗原基因入手，研究對蝦抗病毒作用機制對于對蝦疫病防控非常重要。

國內(nèi)外已有很多實驗室采用將一部分蝦病毒的功能性基因通過pVAX1或pcDNA3.1載體，以肌肉注射的方式注射到蝦體內(nèi)，從而在體內(nèi)表達出蛋白，取得了很好的試驗效果［4，5］。張敬艷等［6］通過VP28重組核酸疫苗肌肉注射和飼料添加的形式對凡納繽對蝦抗WSSV感染的保護效果，實驗證明在注射組中VP28的相對保護率為22.4%，飼料免疫組中VP28的相對保護率可達到36.84%，進一步研究表明蝦STAT基因、Dicer基因、Argonaute基因都有明顯升高。魏國強［7］將含有VP28基因的重組桿狀病毒感染家蠶蛹，配制成藥餌口服免疫鰲蝦，結(jié)果表明該疫苗可以激活鰲蝦血清中抗菌活力、溶菌活力、酚氧化酶活性等活性，說明VP28囊膜蛋白具有增強蝦體免疫功能的作用。

5 結(jié)論

（1）DNA疫苗經(jīng)對蝦口服免疫10 d和20 d后均可以在蝦鰓中檢測到VP28基因和VP19基因的表達，且20 d后的表達量高于10 d的表達量。說明口服免疫可以在對蝦體內(nèi)進行表達，口服疫苗的時間較長可以有效提高其免疫保護性，更詳細的結(jié)果還需要進一步研究。

（2）構(gòu)建的DNA疫苗經(jīng)過口服免疫對蝦均可以使蝦具有抗WSSV感染保護效果，其中pVAX1.0-VP19-VP28多價疫苗的保護性效果比單價疫苗效果好。說明WSSV病毒表面抗原VP19和VP28基因具有有效的免疫保護性，但其作用位點和引發(fā)對蝦體內(nèi)相應免疫因子的表達等問題還需要進一步的深入研究。

［1］Li ghmer D V.A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for disease of cultured penaeid shrimp［M］.Baton Rouge Louisiana USA：World Aquaculture Society，1996：304.

［2］章躍陵，王三英，彭宣憲.無脊椎動物適應性免疫的研究進展［J］.水產(chǎn)科學，2005，24（8）：43-45.

［3］朱建中，陸承平.對蝦白斑綜合癥病毒在鰲蝦動物模型的感染特性［J］.水產(chǎn)學報，2001，25（1）：47-51.

［4］李響，劉慶慧，侯林.DNA疫苗與多糖類免疫促進劑在對蝦疾病控制上的應用研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2008，29（11）：52-54.

［5］Wang S H，Chen J C.The protective effect of chitin and chitosan against Vibrio alginolyticus in white shrimp Litopenaeus vannamei［J］.Fish Shellfish Immunology，2005，19（3）：191-204.

［6］張敬艷，劉慶慧，黃倢.vp28重組核酸疫苗對凡納濱對蝦抗WSSV感染的免疫反應和保護效果［J］.動物醫(yī)學進展，2008，29（11）：52-54.

［7］魏克強，許梓榮.家蠶蛹表達的重組VP28疫苗對克氏原鰲蝦的抗病毒保護效應［J］.實驗生物學報，2006，39（6）：572-536.

Research on Immune Protection of White Spot Syndrome Virus Surface Antigen Gene

Zhang Na，Liu Xiao
（Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong，524000）

In this report，we constructed multivalent DNA vaccine by the combination of gene VP19、VP28 and tested their protective effects on the shrimp against the challenge of White Spot Syndrome Virus（WSSV）.The results indicated that DNA vaccines could protect shrimp from WSSV infection.The best one of them was PVAX1.0-VP19-VP28 multivalent DNA vaccine.

Litopenaeus vannamei；White Spot Syndrome Virus；Surface Antigen Gene；Immune Protection

S941.41

E-mail：vien512@126.com

廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2012GDK07）

2014-08-15