魏斌 陸井蓮 魏云計 張科 朱臻怡 柏愛旭 馮民 王小晉

（淮安出入境檢驗檢疫局 江蘇淮安 223001）

氣質(zhì)聯(lián)用法檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚含量并用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜驗證

魏斌 陸井蓮 魏云計 張科 朱臻怡 柏愛旭 馮民 王小晉

（淮安出入境檢驗檢疫局 江蘇淮安 223001）

改進(jìn)了水產(chǎn)品中己烯雌酚的檢測方法。樣品用乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱凈化，BSTFA-TMCS吡啶溶液80°C衍生；經(jīng)過HP-5MS（30m×0.25mm，0.25 μm）毛細(xì)色譜柱分離，再經(jīng)過單四級桿質(zhì)譜儀選擇離子掃描（m/z：383、397、412、413）確定兩種結(jié)構(gòu)的衍生物，用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測其衍生物從而間接檢測己烯雌酚。以反式衍生物做定量物質(zhì)，在5-180 μg/kg濃度范圍獲得良好線性（R=0.995）；3個添加濃度（1、2、5 μg/kg）下的平均回收率為90.15%-92.82%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%-9.3%。陽性樣品經(jīng)過乙酸乙酯提取后吹干，HLB固相萃取柱凈化，甲醇定容后，用配備RBAX SB-C18柱（2.1×150mm，3.5 μm）的高分辨率液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行驗證，確保檢測的可靠性。

己烯雌酚；水產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；衍生化

1 前言

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）為人工合成的雌性激素，純的DES為無色晶體或白色晶體粉末，易溶于乙醇、氯仿、乙醚、油類以及強(qiáng)堿性溶液，難溶于水，曾用于臨床上一些婦科疾病的治療和養(yǎng)殖業(yè)用于促進(jìn)動物生長，但是其對人體和動物的危害也日益凸顯。上世紀(jì)60年代，世界各國已經(jīng)開始在動物飼料中禁止添加，在水產(chǎn)品中規(guī)定不得檢出［1］。2002年，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告，DES及其鹽、酯制劑停止在食用動物中使用，第235號公告規(guī)定在動物性食品中不得檢出，第1163號公告規(guī)定在水產(chǎn)品中不得檢出［2］。

目前對于水產(chǎn)品DES的檢測有ELISA法、HPLC法、GC-MS法和LC-MS/MS法［3］。HPLC法的檢測限高達(dá)250 μg/kg［4］，顯然不符合相關(guān)公告中不得檢出的要求；而ELISA法雖然檢測限比較低，但只能作為一種篩選方法；另外LC-MS/MS法也可以作為DES的檢測方法且無需衍生，但一方面與之相對應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22963-2008只將測量范圍局限于河豚魚和鰻魚，所以此法也不能廣泛用于水產(chǎn)品中DES的檢測，另一方面LC-MS/MS儀器昂貴，檢測成本較高，不適合大規(guī)模的篩查檢測。農(nóng)業(yè)部1163號公告-9-2009所規(guī)定的氣質(zhì)聯(lián)用法一直是廣大水產(chǎn)品檢測實驗室檢測、出證的主要依據(jù)，本項目參考此方法并用液相串聯(lián)質(zhì)譜對陽性樣品加以驗證，使水產(chǎn)品中DES的檢測更為方便、經(jīng)濟(jì)并且有依據(jù)［5-8］。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1試驗樣品

銀魚樣品：超市購買。

2.1.2試劑

甲醇、正己烷、吡啶：色譜級，德國Merck公司；乙酸乙酯：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉：分析純，上海國藥集團(tuán)；衍生化試劑（BSTFA：TMCS=99：1）：美國REGI公司；DES標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

2.1.3主要儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Trace-DSQII，配有EI離子源，美國Thermo Fisher公司；電子天平：PB-203E型，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫氮吹裝置：N-EVAP14165型，美國Organomation聯(lián)合公司；Thermo Finngan TSQ QuantumUltra ENR串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司；進(jìn)樣瓶兼反應(yīng)瓶：2 mL，33號透明硼硅酸鹽玻璃帶藍(lán)色改性硅樹脂密封圈，美國Thermo Fisher公司。

2.2方法

2.2.1氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-5MS彈性石英鍵合毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始柱溫130°C保持1 min，以20°C/min升到180°C保持10 min，再以3°C/min升到230°C保持4min，再以30°C/min升到280°C保持2 min；進(jìn)樣口溫度：250°C；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣：1 μL；樣品抽吸次數(shù)（plunger strokes）：設(shè)為10；進(jìn)樣口內(nèi)含硅烷化玻璃棉不分流進(jìn)樣襯托管。質(zhì)譜部分離子源溫度：230°C；接口溫度：280°C；選擇離子模式；DES正反式衍生物監(jiān)控離子均為：383、397、412、413。

2.2.2樣品處理

（1）粉碎

銀魚魚肉樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎均勻。

（2）提取

稱取5 g試樣（精確到0.01 g）置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10%碳酸鈉溶液3 mL，加入乙酸乙酯15 mL，渦旋1 min后6000 r/min離心10 min。取上層乙酸乙酯溶液于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并2次乙酸乙酯提取液。40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL正己烷溶液溶解殘留物，待凈化。

（3）凈化

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化HLB固相萃取柱，取待凈化液過柱，控制流速不超過2 mL/min，用1 mL正己烷再洗滌梨形瓶，洗滌液過柱。抽干小柱，乙酸乙酯10 mL分3次洗脫小柱，控制洗脫速度小于1滴/s。收集洗脫液于10 mL氮吹管中在50℃下吹干，用1 mL無水乙醚溶解殘留物，再用1 mL無水乙醚洗滌氮吹管，合并2次溶液到2 mL反應(yīng)瓶中并吹干。

（4）衍生化

將上述吹干后的反應(yīng)瓶中加入100 μL吡啶、50 μL衍生化試劑后擰緊密封蓋，渦旋混勻，加入到80℃烘箱中衍生反應(yīng)30 min。等冷卻后40℃水浴下氮吹干，用0.5 mL正己烷定容，漩渦混合后GC-MS上機(jī)檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1提取與凈化方法

選擇二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙腈幾種常見有機(jī)溶劑對銀魚樣品進(jìn)行提取，結(jié)果顯示經(jīng)二氯甲烷提取的回收率較低（＜80%）；氯仿和乙醚提取的回收率均在80%以上，但蛋白質(zhì)及脂類較多，不利于后一步凈化；乙酸乙酯提取的回收率在80%以上且穩(wěn)定，所溶脂類較少，有利于凈化，因此選用乙酸乙酯作為提取液。在提取時加入10%的碳酸鈉溶液后，回收率可達(dá)90%且能有效降低干擾。

根據(jù)DES的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇SLH、HLB、C18和石墨碳黑氨基柱進(jìn)行凈化對比試驗，結(jié)果顯示使用C18柱和石墨碳黑氨基柱的回收率低于50%且淋洗溶劑劑用量較大；SLH柱和HLB柱回收率均可以達(dá)到90%以上，但SLH柱在穩(wěn)定性上不如HLB柱，因此選擇HLB柱。分別用正己烷、正己烷：乙酸乙酯（85：15）和乙酸乙酯對HLB柱進(jìn)行洗脫實驗，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯洗脫效果最好，在10mL洗脫液可達(dá)到回收率最大化。

3.2定性方法

DES沸點(diǎn)為407℃，已經(jīng)超過色譜柱的極限溫度（315℃），并且酚羥基有極大的極性，會吸附在色譜柱上造成儀器污染，故需要衍生化反應(yīng)生成沸點(diǎn)低的硅烷化衍生物，其衍生物EI離子源全掃質(zhì)譜見圖1。

圖1　DES衍生物總離子MS譜圖（經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫搜索確定結(jié)構(gòu)）

m/z 73和m/z 207為硅化合物的碎片，殘留衍生劑也會有此類碎片，故排除此2項。選擇DES部分碎片的離子進(jìn)行監(jiān)控，分別為m/z 383（25%）、m/z 397（25%）、m/z 412（45%）、m/z 413（100%）。其中，m/z 413和m/z 412為衍生物的母離子，m/z 397為失去一個甲基的離子碎片，m/z 383為失去二個甲基的離子碎片。標(biāo)準(zhǔn)液在SIM模式下的色譜圖見圖2。

圖2　10μg/kg濃度的標(biāo)準(zhǔn)液SIM模式下色譜圖

3.3定量方法

DES具有順反異構(gòu)體，藥用DES為反式，但是在標(biāo)準(zhǔn)品中會有極少量順式結(jié)構(gòu)，提取過程和衍生化中也會有順式異構(gòu)體產(chǎn)生，將順式和反式異構(gòu)體加起來方可定量準(zhǔn)確。建立5、10、50、80、180 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液組上機(jī)操作，結(jié)果顯示順式衍生物線性較差，反式衍生物線性可滿足一般定量要求（R= 0.995）；如果將兩者峰面積相加，則能得到較為良好的線性關(guān)系（R＞0.999），見圖3。但是實際操作中，大多數(shù)儀器公司所配分析軟件版本均無法實現(xiàn)把距離較遠(yuǎn)的兩個峰面積進(jìn)行相加并線性擬合，如每次都導(dǎo)出數(shù)據(jù)再導(dǎo)入專業(yè)計算軟件進(jìn)行擬合計算則較為費(fèi)時費(fèi)力，在實際大批量檢測操作中很難實現(xiàn)。因此用反式衍生物定量即可滿足檢測需要，因DES規(guī)定不得檢出，只檢測順式衍生物也能滿足監(jiān)控需要［9］。

圖3　DES順反式衍生物面積之和與濃度的線性關(guān)系

3.4回收率、精密度和定量限

根據(jù)相關(guān)法律法規(guī)，DES為不得檢出，定量限為0.5 μg/kg，圖4即為添加定量限濃度的色譜圖。對于單四級桿的儀器聯(lián)用儀，可以根據(jù)離子碎片的相對豐度排除基質(zhì)的干擾，因此此方法滿足要求。對銀魚樣品分別添加濃度為1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加回收實驗，結(jié)果見表1。

圖4　純凈銀魚樣品（上）和添加0.5 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的銀魚樣品（下）色譜圖對比

表1　銀魚中DES測定的回收率和精密度

3.5衍生化方法的改進(jìn)

對于DES這類帶羥基基團(tuán)強(qiáng)極性、高沸點(diǎn)的化合物進(jìn)行氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測的時候，均需要衍生為低極性、易氣化的化合物。硅烷化衍生是普遍采用的衍生化方式，BSTFA、TMCS組合衍生化試劑也是最常用的衍生化試劑，也可以用N-甲基-N=三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）［11］。另外也可采用?；苌?，比如采用五氟丙酸酐衍生劑［10］。為了和通行標(biāo)準(zhǔn)一致，本項目只研究BSTFA、TMCS組合衍生化試劑，其反應(yīng)原理如圖5所示。農(nóng)業(yè)部公告中衍生化試劑用100 μL，而從經(jīng)濟(jì)性和量取準(zhǔn)確性角度考慮，加入50 μL衍生劑比較合適。

圖5　本項目中DES的衍生原理

分別取標(biāo)DES準(zhǔn)樣品2 μg、5 μg、10 μg、20 μg、50 μg加入50 μL衍生化試劑，加入100 μL吡啶溶液，充分震蕩并在80°C衍生30 min，衍生后吹干定容2 mL上機(jī)檢測，得到良好線性，見圖6，說明50 μL衍生劑足夠線性濃度范圍內(nèi)的檢測要求。但是在氮?dú)獯蹈珊髢H僅用50 μL衍生劑會導(dǎo)致與瓶壁殘留混合不均勻、衍生效率不高、線性不好等問題，圖7為未加吡啶溶劑的衍生效果，線性相關(guān)系數(shù)只有0.990。如果用100 μL吡啶做溶劑，則可以避免此弊端從而獲得良好線性。但衍生完全后，需要將吡啶吹干后再定容上機(jī)，以避免吡啶和衍生劑對毛細(xì)管色譜柱造成的損傷。

圖6　50μL衍生劑與2-50 μg DES反應(yīng)所得線性

3.6液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的驗證

衍生在外標(biāo)法檢測不得檢出的樣品時存在一些不確定因素和檢測及監(jiān)管上的風(fēng)險。除了做平行和添加回收以外，很多有條件的實驗室也采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對陽性樣品進(jìn)行驗證以及排除假陽性。

3.6.1儀器工作條件

色譜條件：RBAX SB-C18柱（2.1×150 mm，3.5 μm）；流動相：A為甲醇，B為H2O；洗脫程序：0-3 min時A由70%線性降至10%并保持4.4 min，7.5 min-10 min時A線性升至70%并保持2.5 min；流量：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；柱溫：35℃。質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子源，負(fù)離子掃描方式；離子源溫度：110℃；洗脫氮?dú)饬髁浚?00 L/h；洗脫劑氣溫度：350℃；電離電壓：2.8 kV；母離子：267eV；子離子和碰撞氣能量分別為：222m/z（36eV），237m/z（29eV），251 m/z（27ev）。

3.6.2樣品處理

將5.0 g樣品均勻粉碎后加入50 mL離心管中，加入100 g/L的碳酸鈉溶液3 mL、乙酸乙酯15 mL，渦旋30 s，超聲提取15 min，離心后取上清液于梨子形瓶中；同樣方法提取殘渣1次；合并乙酸乙酯提取液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL甲醇溶解殘留物，凈化方法與氣質(zhì)方法相同。洗脫液吹干后用1 mL 20%的甲醇水溶液溶解殘留物，過0.22 μm濾膜后無需衍生直接上機(jī)檢測。

3.6.3驗證討論

建立2-1000 μg/kg濃度范圍內(nèi)共7個點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)序列，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9998，說明在不衍生的條件下液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對DES在較大的濃度范圍具有良好的線性響應(yīng)。銀魚空白樣和加標(biāo)0.2 μg/kg的樣品對比如圖8，說明此方法具有較好的靈敏度，適合做為氣質(zhì)方法的補(bǔ)充，來驗證DES。

圖8　空白樣品（上）與添加0.2 μg/kg樣品（下）的液相串聯(lián)質(zhì)譜譜圖

4 結(jié)論

本項目建立的DES氣相色譜質(zhì)譜檢測法，靈敏、可靠、檢測范圍廣、相對成本低。同時用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對陽性樣品進(jìn)行驗證，使實驗結(jié)果更加可靠，排除假陽性。衍生法配合內(nèi)標(biāo)法使用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測更加具有可靠性和說服性，尋找一個廉價可靠的內(nèi)標(biāo)物是今后工作的一個重點(diǎn)。

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Determination of Diethylstilbestol Residue in Aquatic Products by GC-MS and Verification by LC-MS/MS

Wei Bin，Lu Jinglian，Wei Yunji，Zhang Ke，Zhu Zhenyi，Bai Aixu，F(xiàn)eng Min，Wang Xiaojin
（Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian，Jiangsu，223001）

A economical analytical method by chromatograph-mass spectrometer was developed for the diethylstilbestrol（DES）in aquatic products.The samples were extracted with acetic ether，purified by HLB extraction column，and get derivative reaction with BSTFA-TMCS in pyridines at 80°C.The extract was separated on an agilent HP-5MS capillary column（30m×0.25mm，0.25 μm）and detected with high resolution mass spectrometry in SIM mode（m/z：383，397，412，413）.There ware two derivative compounds，Cis-DES-（OTMS）2 and Trans-DES-（OTMS）2 displayed by chromatogram and the Trans-DES-（OTMS）2 was the quantitative compound for DES.The results showed that high correlation coefficients（R=0.995）were obtained within their respective linear ranges when have a range of 5-180 μg/kg.The average recoveries for 1 μg/kg，2 μg/kg，5 μg/kg spiked levels ranged from 90.15%to 92.82%with RSDs of 6.7% -9.3%.The positive samples were verified by LC-MS/MS with RBAX SB-C18 column for higher reliability.

Diethylstilbestrol；Aquatic Products；GC-MS；LC-MS/MS；Derivative Action

C931.2

E-mail：seuwei@126.com

2014-09-18