張蕾，張偉，姜曼

（濟(jì)寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，山東濟(jì)寧272037）

玉米苞葉黃酮微波提取技術(shù)及其抗氧化性質(zhì)研究

張蕾，張偉，姜曼

（濟(jì)寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，山東濟(jì)寧272037）

將微波技術(shù)應(yīng)用提取玉米苞葉黃酮，反應(yīng)速度加快，產(chǎn)品得率提高。研究玉米苞葉黃酮的抗氧化性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：玉米苞葉黃酮具有比VC還強(qiáng)的還原能力，0.2 mg/mL的玉米苞葉黃酮提取液與0.8 mg/mL的VC溶液的還原能力相當(dāng)。玉米苞葉黃酮提取液能夠一定程度地清除對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·，0.05 mg/mL的玉米苞葉黃酮對(duì)O2-的消除率達(dá)到VC的4倍。當(dāng)提取液濃度為1.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除作用高達(dá)83.17%。通過玉米苞葉黃酮提取物對(duì)豆油體系過氧化的抑制作用研究，發(fā)現(xiàn)濃度為0.1%的玉米苞葉黃酮有較好的抑制油脂氧化現(xiàn)象，且抗氧化效果優(yōu)于VC；檸檬酸可以作為增效劑，大大提升玉米苞葉黃酮對(duì)油脂氧化的抑制效果。

微波技術(shù)；玉米苞葉；黃酮；抗氧化

我國(guó)是種植玉米的大國(guó)，玉米苞葉資源豐富。玉米苞葉通常被丟棄，不能有效地利用，甚至影響農(nóng)業(yè)灌溉和排水，或直接燃燒，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。在玉米苞葉中黃酮類化合物的含量是十分豐富的［1-2］，擁有較好的抗氧化能力，是一種綠色天然的抗氧化活性成分，能有效治療冠心病、心絞痛、高血壓等心血管疾病，對(duì)含脂食品的自動(dòng)氧化有一定防止的實(shí)用價(jià)值，是一類值得深入研究的天然產(chǎn)物。

目前對(duì)玉米苞葉黃酮的抗氧化性質(zhì)研究主要集中在清除羥自由基、超氧陰離子自由基方面。但是鮮見將玉米苞葉黃酮應(yīng)用到油脂體系中研究其對(duì)脂質(zhì)的抗氧化能力。文章將應(yīng)用微波技術(shù)輔助提取玉米苞葉總黃酮，系統(tǒng)的研究其還原能力，清除O2-·與·OH的能力，尤其是對(duì)油脂的抗氧化能力。為玉米苞葉資源的深度開發(fā)，更為開發(fā)天然的綠色安全的抗氧化劑提供一定的理論參考。

1儀器與材料

1.1材料

玉米苞葉（均采于山東省濟(jì)寧市同一地點(diǎn)，洗凈、低溫干燥、粉碎、過篩，得粉末狀樣品）；亞硝酸鈉、BHT、氫氧化鈉、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、鹽酸、雙氧水，可溶性淀粉、硫酸亞鐵，碘、三氯甲烷、碘化鉀、乙酸、抗壞血酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉、硝酸鋁、磷酸二氫鈉、酒石酸、三氯乙酸、乙醇、氯化鐵，以上均為分析純；TRIS，上海生工生物工程有限公司；蘆丁（Rutinu），生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備

XH-MC-1型祥鴿實(shí)驗(yàn)室微波合成反應(yīng)器：北京祥鴿科技發(fā)展有限公司；UV—2000型分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；JD200-2型電子天平：上海精密儀器公司；QL-901漩渦混和器：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；FZ102型粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司。

2試驗(yàn)方法

2.1玉米苞葉總黃酮的微波提取

2.1.1玉米苞葉黃酮得率測(cè)定［3］

由于金屬離子能與黃酮類物質(zhì)形成呈紅色的穩(wěn)定絡(luò)合物，所以用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系絡(luò)合物化學(xué)吸光法來制作以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程Y=0.524 4x-0.005 1，R2=0.999 9。

按照以上方法測(cè)出玉米苞葉浸提液的吸光度A，并且通過以上回歸方程計(jì)算出浸提液中總黃酮含量。

2.1.2玉米苞葉黃酮的微波提?。?］

稱取玉米苞葉干粉，用65%的乙醇溶液為溶媒，按照1∶35的料液比進(jìn)行微波提取15 min，微波功率為400 W。提取完畢后進(jìn)行抽濾，加入石油醚（1∶1）進(jìn)行萃取，靜止，除去醚層。然后真空濃縮所得下層溶液。定容后，得到玉米苞葉黃酮的提取液。

2.2玉米苞葉黃酮抗氧化能力測(cè)定

2.2.1還原能力的測(cè)定［5］

配制玉米苞葉黃酮溶液及VC溶液，濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4 mg/mL。分別將2.5 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液（pH6.6）加入到玉米苞葉黃酮溶液、VC溶液中，再加入1%的K3Fe（CN）6溶液2.5 mL，而后將所得的混合物在50℃的條件下進(jìn)行保溫20 min；取出后分別加入10%的TCA溶液（W/V）2.5 mL。于2 000 r/min，離心10 min，取上層清夜5 mL，分別加入1 mL 0.1%的氯化鐵溶液，定容至50 mL，混合均勻。在700 nm波長(zhǎng)下下測(cè)定吸光度（同時(shí)做空白）。吸光度越高，其還原能力越強(qiáng)。

2.2.2對(duì)超氧陰離子自由基O2-的檢測(cè)［6］

在試管中，加入3 mL pH為8.3的Tris-HCl緩沖液，再加入不同濃度的玉米苞葉黃酮提取液及VC溶液（對(duì)照用蒸餾水代替）。25℃條件下，試管預(yù)溫10 min，加入濃度為30 mmol/L的經(jīng)過25℃預(yù)溫10 min的鄰苯三酚溶液12 μL，搖勻后倒入比色杯中。325 nm處，每30秒測(cè)一次吸光值滯后30 s。反應(yīng)5 min后，加入1.0 mL 8 mol/L HC1。同時(shí)以緩沖液作參比，以1 mL試樣溶劑做空白對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3次。清除率的公式為：

2.2.3對(duì)羥自由基·OH的檢測(cè)［7］

10 mL的比色管中，加入1 mL的鄰二氮菲溶液（5×10-3mol/L），加2 mL磷酸緩沖液（PBS）（pH=7.4），充分混勻后，加1.0 mL 7.5×10-3mol/LFeSO4溶液，每加一管立即混勻，再加1.0 mL0.1%的H2O2，最后以H2O補(bǔ)充體積至總體積為10 mL。37℃下，保溫反應(yīng)1 h，在536 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)536（損傷）。玉米苞葉黃酮的清除自由基作用，依上法操作，加入玉米苞葉黃酮提取液后加H2O2，37℃保溫1 h，測(cè)A536（加藥）。未損傷管不加H2O2及玉米苞葉黃酮提取液。羥自由基清除率d計(jì)算方法：

2.2.4在油脂體系中的抗氧化作用

2.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［8］

配置濃度為0.1%的KI-I2溶液，用此標(biāo)準(zhǔn)溶液配置濃度分別為0.197、0.393、0.787、1.575、2.362、3.136、3.937 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述濃度的KI-I2溶液各1 mL，加入2 mL的氯仿-乙酸溶液（V/V=2∶3）后，再添加1 mL 1%（W%）的可溶性淀粉溶液，最后定容至15 mL。經(jīng)搖勻后，取上清液，在585 nm處測(cè)定吸光值（用蒸餾水作為參比）。制作以碘量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.097 7x+ 0.018 8，R2=0.996。

2.2.4.2油脂POV值得測(cè)定

30 g豆油加入抗氧化劑，置于100 mL燒杯中，放在65℃的烘箱中。每48小時(shí)取樣，測(cè)定油脂POV值。

取0.6 g豆油（用蒸餾水為參比作空白試驗(yàn)），加入2.00 mL氯仿-乙酸溶液，搖勻溶解。加入1.00 mL 10%的KI溶液，具塞搖勻，30 s后并置于暗處，進(jìn)行反應(yīng)180 s，再加入1 mL 1%的可溶性淀粉溶液，定容，測(cè)定吸光值（依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算碘的生成量，進(jìn)而依據(jù)下式計(jì)算油脂POV值。

POV（meq/kg）=碘生成量（μmol）/W（g）

3結(jié)果與分析

3.1不同黃酮濃度對(duì)還原鐵體系吸光度的影響

不同黃酮濃度對(duì)還原鐵體系吸光度的影響見圖1。

圖1　不同濃度對(duì)還原體系吸光度的影響Fig.1Effectofconcentrationontheabsorbanceofdeoxidizesystem

選用還原鐵反應(yīng)體系來考察物質(zhì)的還原能力，物質(zhì)的還原能力與吸光值呈正相關(guān)關(guān)系，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，顯色反應(yīng)后則吸光度就越大。所以通過測(cè)定樣液的還原能力來反映物質(zhì)的抗氧化活性。由圖1可以看出，玉米苞葉黃酮及VC的還原能力均隨濃度的升高而增大。在低濃度時(shí)，玉米苞葉黃酮的還原能力強(qiáng)于VC。當(dāng)濃度超過0.6 mg/mL后，其還原能力提高不明顯。玉米苞葉黃酮提取液為0.2 mg/mL時(shí)與0.8 mg/mL的VC溶液的還原能力相當(dāng)。說明玉米苞葉黃酮具有較強(qiáng)的還原能力。

3.2對(duì)超氧陰離子自由基O2-·的清除作用

不同濃度對(duì)O2-·抑制率變化的影響見圖2。

圖2　不同濃度對(duì)O2-·抑制率變化的影響Fig.2Effect of concentration on the variation of ratio of O2-· restrain

由圖2可以看出，玉米苞葉總黃酮對(duì)O2-·的清除作用較為顯著，且黃酮濃度越大清除作用越強(qiáng)。玉米苞葉總黃酮在較低濃度時(shí)顯示出較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基作用，0.05 mg/mL的VC對(duì)超氧陰離子自由基的消除率是玉米苞葉黃酮的1/4。說明玉米苞葉總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較好，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。

3.3對(duì)羥自由基·OH的清除作用

不同濃度對(duì)·OH清除率的影響見圖3。

圖3　不同濃度對(duì)·OH清除率的影響Fig.3Effect of different on the scavenging ratio of·OH

作為反應(yīng)物，F(xiàn)e2+與H2O2作用可作用產(chǎn)生·OH，是一種強(qiáng)氧化劑。鄰二氮菲-Fe2+是一種常用的氧化還原指示劑，可以觀察其顏色變化，來考察溶液的氧化還原狀態(tài)。通過指示劑顏色的變化從而判斷體系中羥自由基含量的多少，以斷定黃酮提取物對(duì)羥自由基的清除作用。如圖3所示，玉米苞葉黃酮類物質(zhì)對(duì)·OH有一定的清除作用，玉米苞葉黃酮提取液濃度越大，對(duì)·OH的清除率越大。當(dāng)提取液濃度為1.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除作用高達(dá)83.17%，而VC對(duì)·OH的清除作用為63.24%。說明玉米苞葉總黃酮清除·OH的能力優(yōu)于VC。

3.4玉米苞葉黃酮在油脂體系中抗氧化作用的研究

3.4.1玉米苞葉黃酮與其他抗氧化劑對(duì)油脂抗氧化作用的比較

油脂中分別加入0.1%的玉米苞葉黃酮、VC、BHT及檸檬酸，每隔48小時(shí)進(jìn)行取樣測(cè)定油脂POV值。

圖4　不同抗氧化劑對(duì)POV的影響Fig.4Effect of different antioxidant on POV of bean oil

由圖4可以看出，在反應(yīng)的初始階段，VC組的POV值較低。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，VC組的POV值增長(zhǎng)速率較快。檸檬酸組和BHT組處理過的豆油樣品的POV值變化情況基本上是相同的。玉米苞葉黃酮組油樣在反應(yīng)初期POV值較其他組高，但是其的抗氧化持久能力較好，反應(yīng)后期其POV值的增長(zhǎng)略高于BHT組和檸檬酸組，低于VC組處理。

3.4.2不同濃度的玉米苞葉黃酮提取液在豆油中的抗氧化作用

不同濃度的玉米苞葉黃酮提取液在豆油中的抗氧化作用見圖5。

圖5　不同濃度對(duì)POV變化的影響Fig.5EffectofconcentrationonthevariationofPOVinthebeanoil

由圖5可以看出，玉米苞葉黃酮黃酮提取液在豆油中就表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用。高濃度的提取液對(duì)豆油體系有較強(qiáng)的抗氧化作用。當(dāng)濃度較低為0.02%，抗氧化效果不顯著；0.04%、0.06%及0.08%三組的POV值差別不明顯；當(dāng)玉米苞葉黃酮提取液的濃度達(dá)到0.1%時(shí)，對(duì)豆油體系的抗氧化作用增強(qiáng)明顯。黃酮提取液濃度的進(jìn)一步增加，樣品的POV值的變化不顯著。

3.4.3不同增效劑對(duì)玉米苞葉黃酮在豆油中抗氧化作用的影響

不同增效劑對(duì)玉米苞葉黃酮在豆油中抗氧化作用的影響見圖6。

圖6　不同增效劑對(duì)POV的影響Fig.6Effect of different material increasing Antioxidant Property on POV of bean oil

由圖6可以看出，增效劑明顯增強(qiáng)玉米苞葉黃酮對(duì)豆油的抗氧化作用，抗氧化效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用玉米苞葉總黃酮。玉米苞葉黃酮-VC組在反應(yīng)初始階段抗氧化效果較好，但時(shí)間越長(zhǎng)，其抗氧化作用減弱。通過四種處理的比較，玉米苞葉黃酮-檸檬酸組的抗氧化效果更加穩(wěn)定和持久。

4結(jié)論

1）在還原鐵反應(yīng)體系中，玉米苞葉黃酮提取液為0.2 mg/mL時(shí)與0.8 mg/mL的VC溶液的還原能力相當(dāng)。說明玉米苞葉黃酮具有較強(qiáng)的還原能力。

2）在鄰苯三酚自氧化體系中，0.05 mg/mL的玉米苞葉黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的消除率是VC的4倍。說明玉米苞葉總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力較好，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。

3）通過Fenton法，表明玉米苞葉黃酮類物質(zhì)對(duì)·OH有一定的清除作用。清除率隨著玉米苞葉黃酮提取液濃度的增大而升高，當(dāng)提取液濃度為1.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除作用高達(dá)83.17%，而VC對(duì)·OH的清除作用為63.24%。說明玉米苞葉總黃酮清除羥基自由基的能力優(yōu)于VC。

4）通過豆油體系的抗氧化實(shí)驗(yàn)，表明玉米苞葉黃酮提取液對(duì)植物性油脂有明顯的抗氧化作用。與其它幾種抗氧化劑（檸檬酸、BHT、VC）相比，在反應(yīng)初期VC的抗氧化作用較強(qiáng)，但不穩(wěn)定。檸檬酸與BHT的抗氧化作用較好，玉米苞葉黃酮抗氧化作用更加穩(wěn)定和持久。同時(shí)檸檬酸作為抗氧化增效劑，能夠顯著增強(qiáng)玉米苞葉黃酮在油脂體系中的抗氧化活性，有效清除過氧化自由基。

5）結(jié)果表明玉米苞葉黃酮是一種很好的天然抗氧化劑，尤其是在清除羥自由基和對(duì)食用油脂脂質(zhì)抗氧化方面。另外，玉米苞葉黃酮原料來源廣泛，大量玉米苞葉被廢棄，因沒能得到有效利用而造成資源浪費(fèi)。所以，玉米苞葉黃酮可望作為一種無毒副作用的天然抗氧化劑在食品工業(yè)中應(yīng)用。

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［7］金鳴，蔡亞欣，李金榮.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2-Fe2+產(chǎn)生的羥自由基［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23（6）：553-555

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Study on Micro-assisted Extracting and Antioxidant Activity of Flavonoids from the Corn-bract

ZHANG Lei，ZHANG Wei，JIANG Man
（Biochemical Engineering Department，Jining Polytechnic，Jining 272037，Shandong，China）

The optimum process conditions of extracting the corn-bract flavonoids by microwave aided method were studied through factor analysis method and orthogonal experimental，and the antioxidant activity was determined.Antioxidative test results show that flavonoid content in corn-bract has the stronger deoxidize ability than VC.Deoxidize ability of 0.2 mg/mL flavonoid content is correspond to 0.8 mg/mL VC.Corn-bract flavonoids had scavenging effect of superoxide anion radicals（O2-·）by the method of pyrogallol auto-oxidation.The strong scavenging effect by 0.05 gm/mL Corn-bract flavonoids was VC's four times.When the concentration was more than 1.4 mg/mL，the clearance rate of·OH reaches 83.17%.Corn-bract flavonoids showed the antioxidant property in lipin.In bean oil，the better concentration for the restrain function of bean oil'oxidation was 0.1% and antioxidant activity of 0.1%corn-bract flavonoids was higher than VC.Citric acid can strong the antioxidant property greatly in the lipin.

microwave extraction；corn-bract；flavonoid；antioxidative

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.004

2014-02-09

張蕾（1981—），女（回），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物分離純化。