陳金娥，王亞君，趙志剛，劉勇麟，張海容

（山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化苦蕎殼黃酮超聲提取工藝

陳金娥，王亞君，趙志剛，劉勇麟，張海容*

（山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

利用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化苦蕎中黃酮的超聲提取條件；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-中心組合法研究了超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、液固比對(duì)黃酮得率的影響。結(jié)果表明，黃酮最佳超聲提取工藝條件為：超聲提取功率50 W，超聲提取時(shí)間26 min，超聲提取溫度53℃，液固比49 mL/g，提取次數(shù)2次，在此條件下黃酮得率為2.02%。

苦蕎黃酮；響應(yīng)面法；超聲提取

苦蕎亦稱“韃靼蕎麥”（Fagopyrum tararium），是一種自然界中藥食兩用的谷類作物，主要產(chǎn)于貴州、四川、云南［1］、山西等地方，富含生物類黃酮、淀粉、維生素、纖維素、脂肪、微量元素和礦物質(zhì)及蛋白質(zhì)等多種生物活性成分。苦蕎作為一種藥食兩用植物，富含以蘆丁為主的黃酮類化合物。研究表明，黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老的作用，并且近年來(lái)有研究證明使用黃酮類化合物還可以降低癌癥發(fā)病率［2］。

目前對(duì)苦蕎皮中黃酮類化合物的提?。?-4］多采用堿提取酸沉淀法、索氏抽提法、乙醇浸提法等，但這些方法普遍存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取產(chǎn)物難分離、產(chǎn)率不高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)［5］。超聲波提取法［6-7］應(yīng)用于苦蕎皮中黃酮的提取，具有省時(shí)、高效、易操作等優(yōu)點(diǎn)，以乙醇為溶劑還能回收利用，降低成本，減少污染，環(huán)境友好等特點(diǎn)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

苦蕎購(gòu)自山西省靈丘?？嗍w殼置于真空干燥箱中60℃恒溫3 h，粉碎、過(guò)40目篩，置于廣口瓶備用。

1.1.2試劑

蕓香葉苷：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；硝酸鋁（分析純）：北京化工廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市北辰方正試劑廠。

1.2儀器

AB204-N型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；752N型紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-100DB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1工作曲線

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［8］。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁法，在510 nm處測(cè)其吸光度值。繪制黃酮工作曲線，得回歸方程：A=10.193C+0.009 8（R2=0.998 4，C單位mg/mL）。

1.3.2苦蕎黃酮的提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.2 g苦蕎殼粉放入100 mL錐形瓶中按一定的液固比加入60%乙醇，超聲提取一段時(shí)間后，高速離心10 min。重復(fù)提取后合并濾液。將提取液定容至25 mL。準(zhǔn)確吸取3.0 mL待測(cè)液置于10 mL比色管中，加80%乙醇至5 mL，加入5%NaNO20.5mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO）30.5mL，搖勻，放置6 min，再加入4%的NaOH溶液4 mL，加80%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min；在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，代入下式計(jì)算黃酮含量（Y%）：

黃酮含量Y（%）=濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×提取液體積（mL）/［原料干重（g）×103］×100%

1.3.3苦蕎黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取苦蕎殼0.2 g，對(duì)液固比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、提取次數(shù)進(jìn)行單因素探索實(shí)驗(yàn)，分別考察這5個(gè)因素對(duì)黃酮收率的影響。

1.3.4Box-Behnken星點(diǎn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

為了分析各因素之間的交互作用對(duì)結(jié)果的影響，分析參數(shù)影響因素，得到最佳的提取工藝，試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，以苦蕎殼黃酮的提取率為考察目標(biāo)，分別以超聲功率、時(shí)間、溫度、液固比對(duì)應(yīng)四個(gè)獨(dú)立變量A、B、C、D，實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼見(jiàn)表1。

2結(jié)果與討論

2.1溶劑濃度的選取

分別用H2O，20%、40%、60%、80%乙醇，無(wú)水乙醇作溶劑，在超聲功率60 W、時(shí)間30 min、液固比45∶1、溫度40℃、提取次數(shù)2次條件下提取，選取最佳溶劑濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　Box-Behnken星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1Factor levels of Box-Behnken design

表2　乙醇濃度對(duì)苦蕎殼總黃酮得率的影響Table 2Effects of ethanol on the flavonoids rates of the tatary buckwheat shell

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1液固比對(duì)總黃酮得率的影響

在超聲時(shí)間為30 min，超聲溫度為40℃，超聲功率為60 W，提取次數(shù)為2的情況下。提取液固比分別為15∶1、30∶1、45∶1、60∶1、75∶1，提取液固比對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1　液固比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1The influence of liquid-solid ratio on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

可以看出液固比較小時(shí)，黃酮產(chǎn)率較低，隨著液固比的增加，產(chǎn)率逐漸增大。但是，過(guò)多的加水量帶來(lái)的產(chǎn)率的提高并不顯著，且會(huì)給后續(xù)分離工作帶來(lái)很大負(fù)擔(dān)。因此，最佳液固比選取45∶1mL/g。

2.2.2超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

在液固比為45∶1，超聲功率為60 W，超聲溫度為40℃，提取次數(shù)為2次的情況下。提取時(shí)間分別為5、15、25、35、45 min，提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2　時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2The influence of extraction time on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

可以看出25 min之前，隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮產(chǎn)率逐漸升高；25 min之后，產(chǎn)率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。因此，選擇最佳超聲時(shí)間為25 min。

2.2.3溫度對(duì)總黃酮得率的影響

在上述選定優(yōu)化條件、提取次數(shù)為2次的情況下，提取溫度分別為30、40、50、60、70℃，提取溫度對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3The influence of temperature on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

實(shí)驗(yàn)表明，溫度超過(guò)40℃時(shí)，黃酮產(chǎn)率快速增大，高溫有利于苦蕎殼總黃酮的快速溶出，因此，選擇50℃為最佳提取溫度。

2.2.4超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

在液固比為45∶1，超聲時(shí)間25 min，超聲溫度為50℃，提取次數(shù)為2次的情況下。提取功率分別為40、50、60、70、80 W，提取功率對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

可以看出在一定范圍內(nèi)增加超聲功率，黃酮產(chǎn)率隨之升高；超聲功率超過(guò)50 W，產(chǎn)率隨功率升高而下降，其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。因此，選擇最佳超聲功率為50 W。

2.2.5提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響

在液固比為45∶1，超聲時(shí)間為25 min，超聲溫度為50℃，超聲功率50 W的情況下。提取次數(shù)分別為1次、2次、3次，提取次數(shù)對(duì)提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖4　超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4The influence of ultrasonic power on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

圖5　提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5The influence of extraction times on the extraction rate of tartary buckwheat flavonoid

提取2次后變化較小，考慮節(jié)時(shí)節(jié)能，提取實(shí)驗(yàn)均采取2次提取。

2.3響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

按表1利用設(shè)計(jì)軟件Design-Expert，得到的四因素三水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)—響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 3Results analysis and program of the design of response surface analysis methods

續(xù)表3實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Continue table 3Results analysis and program of the design of response surface analysis methods

本實(shí)驗(yàn)中，5，10，16、22、23組為中心實(shí)驗(yàn)，其余均為析因?qū)嶒?yàn)，29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)是與自變量A、B、C、D所對(duì)應(yīng)的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

2.3.2方差分析和回歸方程

對(duì)表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，建立回歸方程Y=2.01-3.333×10-3A+0.017B+0.033C+0.05D+ 0.02AB+7.5×10-3AC-0.013AD-7.5×10-3BC-0.012BD-0.01CD-0.056A2-0.074B2-0.059C2-0.1D2。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　方差分析表Table 4The analysis of regression model

續(xù)表4方差分析表Continue table 4The analysis of regression model

由表4可知，本實(shí)驗(yàn)所選模型不同處理間差異較顯著，說(shuō)明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系是顯著的，即這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的；變異系數(shù)（C.V.%值3.20）較低，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)有良好的穩(wěn)定性；模型的相關(guān)系數(shù)R2= 0.843 8，說(shuō)明該模型可靠性較好。從回歸方程模型因變量的方差分析可知，模型一次項(xiàng)A（P=0.851 0），B（P= 0.354 8）差異不顯著，C（P=0.076 3），D（P=0.012 3）差異顯著，二次項(xiàng)D2（P=0.000 8）差異極顯著。表明液固比對(duì)總黃酮得率的主效應(yīng)明顯。依據(jù)系數(shù)值可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為：液固比>溫度>時(shí)間>超聲功率［9］。

2.4響應(yīng)面圖分析

為了進(jìn)一步考察4個(gè)試驗(yàn)因子：超聲提取功率（A）、時(shí)間（B）、溫度（C）、液固比（D）的交互作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，對(duì)回歸模型采用降維法分析，即可得到兩因子的回歸模型，并通過(guò)Design-Expert7.0軟件繪制出響應(yīng)面曲線圖來(lái)進(jìn)行直觀的分析見(jiàn)圖6～圖11分別顯示了6組以得率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖，從響應(yīng)面圖可以直觀地反應(yīng)出兩變量交互作用地顯著程度。

圖6　超聲功率和時(shí)間對(duì)黃酮得率響應(yīng)面Fig.6The mutual interactions of ultrasonic time and power on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖7　超聲功率和溫度對(duì)黃酮得率響應(yīng)面Fig.7The mutual interactions of ultrasonic power and temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖8　超聲功率和液固比對(duì)黃酮得率響應(yīng)面Fig.8The mutual interactions of ultrasonic power and solid-liquid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖9　時(shí)間和溫度對(duì)黃酮得率響應(yīng)面Fig.9The mutual interactions of ultrasonic time and temperature on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖10　時(shí)間和液固比對(duì)黃酮得率響應(yīng)面Fig.10The mutual interactions of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

圖11　溫度和液固比對(duì)黃酮得率響應(yīng)面Fig.11The mutual interactions of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat flavonoid

由圖6和圖10可看出，超聲功率和時(shí)間及液固比和時(shí)間兩個(gè)因素共同作用對(duì)響應(yīng)供過(guò)響應(yīng)值的影響較顯著。由圖8和圖11可看出超聲功率和液固比及溫度和液固比兩個(gè)因素共同作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著［10］。

2.5最優(yōu)工藝條件求取

為了進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)的值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，求導(dǎo)方程整理得：

求解方程組得：A=－0.025 9，B=0.079 6，C=0.251 8，D=0.234 4。最后求得超聲功率、時(shí)間、溫度、液固比的最適值分別為：a=49.74 W，b=25.8 min，c=52.52℃，d= 48.5 mL/g。此時(shí)，黃酮的理論得率為2.022%。根據(jù)實(shí)際情況取最佳的提取工藝參數(shù)為：超聲功率50 W、時(shí)間26 min、溫度53℃、液固比49 mL/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，得率為2.02%，與理論值相符。因此，采用響應(yīng)面法得到的提取條件參數(shù)相對(duì)較為可靠，具有使用價(jià)值。

3結(jié)論

通過(guò)Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)—響應(yīng)面分析法，能夠可靠地進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)以及數(shù)據(jù)處理，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用這一方法對(duì)苦蕎殼黃酮提取的超聲工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用DesignExpert 7.0軟件四因素三水平的實(shí)驗(yàn)，確定出了苦蕎殼黃酮超聲提取的優(yōu)化工藝條件為：超聲功率50 W、時(shí)間26 min、溫度53℃、液固比49 mL/g，得率為2.02%。實(shí)驗(yàn)證明，采用響應(yīng)面法獲得的苦蕎中黃酮的超聲提取工藝條件，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，科學(xué)可行。

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The Study of Ultrasonic Extraction and Optimization on the Flavonoids of Tatary Buckwheat with Response Surface Analysis Methods

CHEN Jin-e，WANG Ya-jun，ZHAO Zhi-gang，LIU Yong-lin，ZHANG Hai-rong*
（Institute of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

The ultrasonic extraction conditions of the flavonoids of the Tatary Buckwheat shell were optimized with response surface analysis methods on the basis of single-factor experiments.The effects of ultrasonic power，ultrasonic time，ultrasonic temperature，liquid to solid ratio on yield of flavonoids of the Tatary Buckwheat shell were investigated using a central composite design.The results showed that the best conditions of ultrasonic extraction flavonoids were as follows：50 W of ultrasonic extraction power，26 min of extraction time，53℃of extraction temperature，49 mL/g of liquid to solid ratio，two grade of extraction times by Design Expert 7，the yield of flavonoids was up to 2.02%in optimal condition.

the Tatary Buckwheat flavonoids；response surface analysis methods；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.006

2013-08-28

忻州師范學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助計(jì)劃（xk201402）；山西省高等學(xué)校教學(xué)改革項(xiàng)目（2015-100）；忻州師范學(xué)院應(yīng)用化學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐基地（2013-31）；山西省教育廳重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目（20141010）作者簡(jiǎn)介：陳金娥（1957—），女（漢），副教授，本科，主要從事植物成分分離分析。

張海容，男，教授，博士，主要從事有機(jī)分析。