吳俊靜　彭先文　喬木等

摘要：為了進(jìn)一步篩選獲得抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）增殖的候選miRNA，為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）防治及豬的抗病育種提供新策略，通過(guò)3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）測(cè)序獲得了豬CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶點(diǎn)。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可極顯著（P<0.01）抑制熒光素酶的相對(duì)活性，其中miR-181d抑制效果最佳。

關(guān)鍵詞：雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；miRNA；CD163基因；豬

中圖分類號(hào)：R318； Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）19-4854-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.052

Abstract： CD163 gene is one of the most important PRRSV entry mediators， which determines the cell susceptibility for PRRSV. If we can identify the miRNAs inhibiting CD163 gene expression， the anti-PRRSV miRNAs can be further acquired. In the present study， we got the full porcine CD163 3′UTR sequence by 3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends） sequencing， and found that it existed targeting sequences of miRNA，including miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262，by bioinformatics analysis. The results of dual luciferase reporter assay showed that miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262 could significantly reduced the related luciferase activity of reporter construct compared with the NC control group （P<0.01）， especially for miR-181d. These results indicated that the 4 miRNAs could directly target to porcine CD163 gene，which layed a foundation for the further screening of anti-PRRSV miRNAs in the future.

Key words： dual luciferase reporter system； miRNA； CD163 gene； pig

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種危害極大的傳染性疾病，因發(fā)病豬耳部發(fā)紺呈紫紅色斑塊狀，又稱藍(lán)耳病，主要導(dǎo)致母豬繁殖障礙（流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等）、各年齡階段豬的呼吸道癥狀、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等[1]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV侵入宿主細(xì)胞首先通過(guò)與細(xì)胞膜表面上的特異性受體結(jié)合，利用細(xì)胞內(nèi)吞作用感染易感細(xì)胞[2]，因此這些特異性受體存在與否決定了細(xì)胞對(duì)PRRSV的易感性。CD163是PRRSV感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體之一，參與介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞和增殖。

CD163是一種清道夫受體（Scavenger receptor），在PRRSV感染宿主細(xì)胞中起重要作用，主要參與病毒脫殼和基因組RNA的釋放過(guò)程。在PRRSV非易感細(xì)胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中轉(zhuǎn)染CD163真核表達(dá)質(zhì)?？梢允惯@些細(xì)胞系感染 PRRSV 并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生子代病毒粒子[3，4]。CD163的表達(dá)量高低與PRRSV復(fù)制效率呈正相關(guān)，上調(diào)CD163表達(dá)會(huì)增加病毒增殖，而下調(diào)CD163表達(dá)可降低病毒增殖[5]。豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）是PRRSV的天然靶細(xì)胞，而采用CD163的抗體可以有效阻止PRRSV感染PAM[3]。永生化的PAM細(xì)胞系因無(wú)法正常表達(dá)CD163而變?yōu)镻RRSV非易感細(xì)胞[6]。CD163是PRRSV感染過(guò)程中的關(guān)鍵受體，在PRRSV感染PAM或者是Marc-145細(xì)胞的過(guò)程中都必須要有CD163的表達(dá)。

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22 bp、高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA分子，其表達(dá)具有明顯的組織和時(shí)間特異性，能夠互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的與靶mRNA結(jié)合，使mRNA降解或介導(dǎo)其翻譯抑制。成熟的miRNA可同時(shí)封閉多個(gè)靶基因的翻譯，干預(yù)調(diào)節(jié)miRNA可改變多個(gè)靶基因的表達(dá)水平，且干預(yù)調(diào)節(jié)效率很高[7]。miRNA在病毒感染和宿主天然免疫中起關(guān)鍵作用，參與病毒與宿主的互作，它有可能是細(xì)胞最原始的免疫方式。在小鼠中發(fā)現(xiàn)miR-126可通過(guò)靶向作用于VEGFR2調(diào)控病源引起的天然免疫反應(yīng)[8]。在人巨噬細(xì)胞中，miR-155可靶向作用于SOCSS1，刺激干擾素信號(hào)通路下游基因表達(dá)，參與抗病毒天然免疫過(guò)程[9]。

豬CD163基因在PRRSV感染宿主豬細(xì)胞的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，同時(shí)miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能具有重要作用，廣泛參與機(jī)體抗病毒反應(yīng)。miRNA多數(shù)是通過(guò)與靶基因的3′UTR區(qū)序列特異性識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，因此本研究構(gòu)建了豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，篩選鑒定了靶向調(diào)控豬CD163基因的miRNA，可為篩選抑制PRRSV感染增殖的miRNA奠定基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Marc-145細(xì)胞系由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)保存，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對(duì)Marc-145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。psi-CHECK2載體、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒、T4 DNA連接酶和感受態(tài)大腸桿菌DH5α購(gòu)自Promega公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自HyClone公司；Trizol試劑和脂質(zhì)體（LipofectaminTM 2000）購(gòu)自Invitrogen公司；3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）試劑盒、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTP均購(gòu)自Takara公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；miRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司人工合成。

1.2 豬CD163基因的3′RACE測(cè)序

提取湖北白豬（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)）肝臟組織總RNA，使用Takara的3′RACE Adaptor引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為10 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。

參考豬CD163基因GenBank的cDNA序列（登錄號(hào)：NM_213976.1）設(shè)計(jì)外、內(nèi)兩個(gè)上游特異性引物（外引物：5′-CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC-3′和內(nèi)引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3′），結(jié)合Takara 3′RACE試劑盒的外、內(nèi)兩個(gè)下游錨定引物（外引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′和內(nèi)引物：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′），利用槽式降落PCR擴(kuò)增3′UTR區(qū)片段。第一輪外引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，其中反轉(zhuǎn)錄cDNA 2 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱4 min；95 ℃變性30 s，62～52 ℃退火30 s（每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃延伸90 s，共20個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共15個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。第二輪內(nèi)引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，其中第1輪PCR產(chǎn)物1 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱4 min；95 ℃變性30 s，64～54 ℃退火30 s（每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃），72 ℃延伸90 s，共20個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，共15個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，從瓊脂糖回收目的DNA，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 靶向豬CD163基因3′UTR的miRNA預(yù)測(cè)

利用生物信息學(xué)工具TargenScan，參考人CD163基因3′UTR序列，預(yù)測(cè)調(diào)控CD163基因表達(dá)的物種間保守miRNA（miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-23b、miR-23c等）及其作用靶位點(diǎn)序列（TGAATGT和AATGTGA），詳見(jiàn)http：//www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_61/view

_gene.cgi？taxid=9606&rs=NM_203416&members=&showcnc=0&shownc=0&showncf=。對(duì)比新擴(kuò)增獲得的豬CD163基因3′UTR區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)也包含這些保守miRNAs的靶位點(diǎn)序列（TGAATGT和AATGTGA）。人工合成miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-4262及陰性對(duì)照（NC）miRNA模擬物。

1.4 豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

結(jié)合豬CD163基因CDS序列和以上3′RACE測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)包含豬CD163基因3′UTR區(qū)的1對(duì)引物，PCR擴(kuò)增豬CD163基因3′UTR區(qū)的 469 bp片段。所用引物：上游引物：5′-CCGCTCGAGTCGCT

CATCTTTTGTTGC-3′，含有XhoⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)（CTCGAG）和保護(hù)堿基（CCG）；下游引物：5′-ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG-3′，含有NotⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)（GCGGCCGC）和保護(hù)堿基（ATTT）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)熱4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，5個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用過(guò)柱離心的方法從瓊脂糖回收純化PCR產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

將切膠純化回收后的PCR產(chǎn)物及psiCHECK-2載體分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，然后采用T4 DNA 連接酶將線性化psiCHECK-2載體與CD163基因3′UTR 片段相連，連接體系為10 μL：psi-CHECK2載體2 μL，CD163基因3′UTR擴(kuò)增片段6 μL，T4連接酶1 μL，10× T4 DNA連接酶緩沖液1 μL?；旌象w系于4 ℃連接過(guò)夜。取5 μL的連接產(chǎn)物連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α，采用菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，并將用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為psi-CHECK2-CD163-3UTR。

1.5 熒光素酶活性的檢測(cè)endprint

在轉(zhuǎn)染前1 d，將5×104個(gè)細(xì)胞接種在24孔板中，加入無(wú)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，更換細(xì)胞新鮮培養(yǎng)液，用Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體，每孔加入200 ng psi-CHECK2-CD163-3UTR質(zhì)粒、80 nmol/L各miRNA、2 μL LipofectaminTM 2000脂質(zhì)體。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入無(wú)菌的5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，24 h后裂解細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶活性。上述試驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)平行孔，以不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

用冷PBS清洗細(xì)胞2次，加入120 μL細(xì)胞裂解液1×PLB，室溫?fù)u晃15 min充分裂解細(xì)胞，然后將裂解液收集至1.5 mL離心管中，按照Promega 公司的雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Dual-Luciferase Reporter Assay）說(shuō)明書(shū)提供的方法，采用PerkinElmer公司的VICTORTM X2 Multilabel Plate Reader儀器檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

螢火蟲(chóng)熒光值（M1）為內(nèi)參熒光值，海腎熒光值（M2）為報(bào)告基因檢測(cè)值，結(jié)果以M2與M1的比值（M2/M1）計(jì)算，利用SPSS 17.0對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CD163基因的3′RACE測(cè)序及分析

miRNA多數(shù)是通過(guò)與靶基因的3′UTR區(qū)序列特異性識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，而目前GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬CD163基因的3′UTR序列并不完整，無(wú)法進(jìn)行調(diào)控豬CD163基因表達(dá)miRNAs的篩選鑒定研究。為了獲得豬CD163基因3′UTR的全序列，采用3′RACE結(jié)合槽式降落PCR技術(shù)，成功擴(kuò)增獲得了豬CD163基因的特異性片段（圖1），片段測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的豬CD163 mRNA序列（NM_213976.1）進(jìn)行比對(duì)分析，獲得豬CD163 CDS下游（3′）新的181 bp核苷酸序列，該序列包含PolyA特征的3′UTR核苷酸序列。

利用TargetScan生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)可調(diào)控CD163基因3′UTR區(qū)的物種間保守miRNA（miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-23b、miR-23c等）及作用靶位點(diǎn)序列（TGAATGT和AATGTGA），發(fā)現(xiàn)新擴(kuò)增獲得的豬3′UTR區(qū)也包含這些保守miRNA的作用靶位點(diǎn)序列。

2.2 豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)獲得的豬CD163基因的CDS和3′RACR測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)包含3′UTR區(qū)的1對(duì)引物，在5′端和3′端分別引入XhoⅠ和NotⅠ酶切識(shí)別位點(diǎn)及保護(hù)堿基，利用PCR方法擴(kuò)增獲得了豬CD163基因的469 bp長(zhǎng)的目的片段（圖2），將該片段插入雙熒光素酶報(bào)告載體psi-CHECK2的XhoⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建豬CD163基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體psi-CHECK2-CD163-3UTR，構(gòu)建的載體結(jié)構(gòu)如圖3所示。采用菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并用XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，證實(shí)酶切后得到的469 bp的豬CD163基因3′UTR片段與預(yù)期大小相符（圖4）。抽提的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序再次驗(yàn)證插入序列的正確性。

2.3 miRNA對(duì)豬CD163基因3′UTR的調(diào)控

為了檢測(cè)以上預(yù)測(cè)的miRNA是否能靶向調(diào)控豬CD163基因3′UTR，將psi-CHECK2-CD163-3UTR和相應(yīng)miRNA模擬物分別共轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果如表1和圖5所示。與NC對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262可以極顯著（P<0.01）降低雙熒光素酶報(bào)告載體psi-CHECK2-CD163-3UTR的熒光素酶活性，其中miR-181d抑制效果最佳（降低46%）。說(shuō)明miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可靶向作用于豬CD163基因3′UTR，對(duì)豬CD163基因具有一定的調(diào)控作用。

3 小結(jié)與討論

CD163是PRRSV感染宿主細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵受體，主要參與病毒脫殼和基因組RNA的釋放過(guò)程。它由單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞特異表達(dá)，結(jié)構(gòu)包含信號(hào)肽、9個(gè)串聯(lián)的SRCR末端重復(fù)序列、一個(gè)跨膜區(qū)以及胞質(zhì)尾區(qū)。2005年Welch等[10]首次發(fā)現(xiàn)CD163與PRRSV感染有關(guān)，PRRSV非易感系的豬腎細(xì)胞表達(dá)CD163后，可以被PRRSV感染并產(chǎn)生子代病毒。Calvert等[3]將從各種細(xì)胞系中分離得到CDl63分子轉(zhuǎn)染到PRRSV不敏感的細(xì)胞系后，這些細(xì)胞內(nèi)都產(chǎn)生子代病毒粒子。并且CD163表達(dá)量的高低與PRRSV復(fù)制效率呈正相關(guān)，上調(diào)CD163表達(dá)會(huì)增加病毒增殖，而下調(diào)CD163表達(dá)可降低病毒增殖[5]。Ren等[11]發(fā)現(xiàn)豬CD163基因CDS區(qū)域序列變異與豬PRRSV易感性顯著相關(guān)。

近幾年有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA參與調(diào)控PRRSV感染。在人工miRNA方面，Xiao等[12]和Xia等[13]針對(duì)PRRSV病毒基因組特點(diǎn)，設(shè)計(jì)人工miRNA，利用內(nèi)源性miRNA代謝途徑加工成熟后靶向降解PRRSV RNA，從而達(dá)到抑制病毒感染的效果。這表明人工miRNA的應(yīng)用可能成為有效抗PRRSV的新策略。在內(nèi)源性抗PRRSV增殖的miRNA研究方面，Wang等[14]發(fā)現(xiàn)與天然免疫相關(guān)的miR-125b能顯著抑制PRRSV的RNA復(fù)制和病毒增殖，miR-125b并不是直接作用于PRRSV的基因組，而是作用于宿主細(xì)胞中NF-κB的抑制因子κB-Ras2，通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路抑制PRRSV的增殖。endprint

CD163在PRRSV感染宿主細(xì)胞過(guò)程中具有重要作用，PRRSV必須依賴CD163的表達(dá)才能在宿主細(xì)胞中繁殖。因此，如果能鑒定獲得抑制CD163基因表達(dá)的miRNA，就可以進(jìn)一步篩選獲得抑制PRRSV增殖的候選miRNA，為PRRS防治及豬的抗病育種提供新策略。本研究擴(kuò)增獲得了豬CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶點(diǎn)。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可靶向作用豬CD163基因的3′UTR，其中miR-181d抑制效果最佳。這4個(gè)miRNA也可能是潛在的能抑制PRRSV增殖的miRNA。然而，本結(jié)果還需要借助體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

Guo等[15]發(fā)現(xiàn)miR-181能與PRRSV RNA非編碼序列結(jié)合，抑制PRRSV感染，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼻滴miR-181模擬物可抑制PRRSV在仔豬體內(nèi)增殖，緩解攻毒后仔豬發(fā)病癥狀。研究還表明宿主miR-181在PAM細(xì)胞表達(dá)量較低，而在非易感細(xì)胞或組織中高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，Gao等[16]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-181能靶向抑制CD163基因表達(dá)，從而抑制PRRSV感染，與本研究結(jié)果一致。Zhang等[17]研究結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)miR-23能抑制PRRSV感染，而干擾掉內(nèi)源性miR-23表達(dá)會(huì)增強(qiáng)PRRSV增殖，表明miR-23具有一定的抗PRRSV增殖效應(yīng)。他們進(jìn)一步研究指出miR-23能通過(guò)激活I(lǐng)RF3/IRF7誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，從而抑制PRRSV感染。然而并未研究miR-23與CD163基因的靶向調(diào)控關(guān)系，很可能miR-23能通過(guò)多種途徑（包括抑制受體基因CD163的表達(dá)）達(dá)到抑制病毒的效果。有關(guān)miR-4262的相關(guān)研究報(bào)道比較少，其功能還不十分明確。

本研究利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)明確了miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262能靶向作用豬CD163基因的3′UTR，對(duì)豬CD163基因具有負(fù)向調(diào)控作用，可為進(jìn)一步篩選抗PRRSV增殖miRNA奠定基礎(chǔ)。

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