李佩華

摘要：采用組織培養(yǎng)方法，以馬鈴薯 （Solanum tuberosum L.）品種米拉（S. tuberosum cv. Mira）為供試材料，研究重金屬鉛（Pb）、鎘（Cd）脅迫對(duì)馬鈴薯葉綠素含量及葉片超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，未經(jīng)處理的馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整清晰，片層排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)緊密，分布均勻，細(xì)胞壁平滑致密，細(xì)胞核中核仁顏色清晰，結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)鉛脅迫后，葉綠素含量下降，葉綠體腫脹，類(lèi)囊體排列紊亂，結(jié)構(gòu)被破壞，線粒體膜部分溶解，細(xì)胞壁發(fā)生不同類(lèi)型的變化。鎘脅迫后，葉綠素含量顯著降低，片層結(jié)構(gòu)模糊，比對(duì)照出現(xiàn)了更多的淀粉粒，線粒體變形、嵴消失、空泡化，膜系統(tǒng)破壞明顯。說(shuō)明鉛、鎘在馬鈴薯中有一定的蓄積作用，葉綠素含量和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化可作為馬鈴薯對(duì)重金屬抗性分析的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鉛；鎘；馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）；葉綠素；超微結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：O614；S532；Q945.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-3974-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.036

Effects of Pb and Cd on Chlorophyll Content and Cell Ultrastructure of Potato

LI Pei-hua

（Institute of Agricultural Sciences， Xichang College， Xichang 615013， Sichuan， China）

Abstract： With potato variety （Solanum tuberosum L. cv. Mira） as test material， through tissue culture experiments， effects of Pb and Cd pollution stress on the chlorophyll content and ultrastructure of potato were studied. The results showed that cell ultrastructure was clear in the control group； the lamell was in good shape and mitochondrial was averaged in chlroplast； cell wall was smooth and dense； and the nucleus was integrity with clear nucleolus. But the chlorophyll content decreased under Pb stress. And chloroplast began swelling along with ambiguity in thylakoid. As the same time， mitochondrial could be destroyed while cell wall suffered to varying degrees of destruction. Under Cd stress， the chlorophyll content reduced obviously； and the lamellar structure deformed as more starch grains appeared； the mitochondrial could be deformed and deficient in cristae and inside vacuolated while membrane loose integrity. It was concluded that the accumulation of Pb and Cd in potato has certain effect， the change of chlorophyll content and ultrastructure of cells could be taken as the basis for the resistance mechanism to heavy metals.

Key words： Pb；Cd；potato （Solanum tuberosum L.）； chlorophyll； cell ultrastructure

在全球工業(yè)迅猛發(fā)展和經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)的現(xiàn)代社會(huì)，城市化的推進(jìn)所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，其中以重金屬的污染最為突出，其直接威脅著人類(lèi)賴(lài)以生存的環(huán)境，已成為人類(lèi)日常生活的安全隱患之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)目前受鉛、鎘等重金屬污染的土壤面積已達(dá)2.0×107 hm2，約占耕地總面積的1/5[1]，每年因重金屬污染導(dǎo)致的糧食經(jīng)濟(jì)損失至少達(dá)200億元[2]，重金屬污染已成為當(dāng)今世界備受關(guān)注的重大環(huán)境問(wèn)題之一[3，4]。重金屬毒性大，且半衰期較長(zhǎng)，若長(zhǎng)期在環(huán)境中積累，會(huì)危害生態(tài)系統(tǒng)安全，影響動(dòng)物、植物的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，進(jìn)而通過(guò)食物鏈富集到食物金字塔的頂端，最終進(jìn)入人體中[5-13]危害人體健康。重金屬污染中又以鉛、鎘的遷移能力最強(qiáng)，危害最為嚴(yán)重；鉛可在人體和動(dòng)物、植物組織中積累并長(zhǎng)期蓄積，其主要來(lái)源于工業(yè)廢水及汽車(chē)尾氣；鎘則是一種劇毒的重金屬元素，主要來(lái)源于工業(yè)“三廢”；所以這2種重金屬已成為目前的研究熱點(diǎn)[14]。近年來(lái)，鎘米、血鉛等重金屬污染事件時(shí)常見(jiàn)諸報(bào)端，且多集中在經(jīng)濟(jì)作物對(duì)鎘、鉛等的吸收、積累與轉(zhuǎn)移方面。目前，國(guó)內(nèi)大多數(shù)城市郊區(qū)的土壤都受到了不同程度的污染，許多糧食、蔬菜、水果等食物中鉛、鎘等重金屬含量接近臨界值或超標(biāo)。馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界四大糧食作物之一，其產(chǎn)量?jī)H排在小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）和水稻（Oryza sativa L.）之后[15]，因其具有易栽培、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、經(jīng)濟(jì)效益大的特性而成為食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)不可缺少的重要原料之一。中國(guó)是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，種植面積廣，栽培品種多，馬鈴薯在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域以及消費(fèi)市場(chǎng)上占有不可替代的地位，為國(guó)家創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)財(cái)富。然而隨著土壤重金屬污染面積的不斷擴(kuò)大，加上其食用部分直接與土壤接觸，所以受重金屬鉛、鎘污染毒害程度的威脅在不斷加大，因此研究重金屬對(duì)馬鈴薯的脅迫毒害機(jī)理具有十分重要的意義。試驗(yàn)以馬鈴薯為供試材料，研究了鉛、鎘脅迫下馬鈴薯的葉綠素含量及葉片超微結(jié)構(gòu)的變化，為探討馬鈴薯對(duì)重金屬的抗性機(jī)理提供生理學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯品種為米拉（S. tuberosum cv. Mira），試驗(yàn)材料為米拉脫毒組培苗，由西昌學(xué)院高原及亞熱帶作物實(shí)驗(yàn)室提供。試劑主要有乙醇、丙酮、磷酸、戊二醛（用pH=6.8的磷酸緩沖液配制）、四氧化鋨（OsO4）固定液（1%鋨酸）、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛以及Epon812樹(shù)脂等。主要儀器有島津UV-2401PC型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（日本島津制作所）、Ultra Cut-E型超薄切片機(jī)（奧地利Reichert-Jung公司）、日立H-600IV型透射式電子顯微鏡（日本日立株式會(huì)社）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在四川省西昌學(xué)院的組織培養(yǎng)室進(jìn)行，分別配制不同鉛、鎘污染水平處理的MS培養(yǎng)基，鉛脅迫處理水平分別為0（CK）、1 000 mg/kg，鉛用Pb（CH3COO）2配制；鎘脅迫處理水平分別為0（CK）、100 mg/kg，鎘用CdCl2·2.5H2O配制，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.8，在高溫高壓鍋內(nèi)滅菌，冷卻。在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)接含有腋芽、長(zhǎng)度為2 cm的米拉脫毒組培苗莖切段，按照原來(lái)的極性生長(zhǎng)方向著位于培養(yǎng)瓶中，每個(gè)處理5瓶，每瓶10苗，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室（25 ℃，每日光照12 h，光照度為2 000 lx）內(nèi)培養(yǎng)，重金屬脅迫處理30 d后，收獲供試植物。

1.3 分析方法

1.3.1 葉片色素含量的測(cè)定 取馬鈴薯主莖從上向下數(shù)第三、第四對(duì)葉片，采用乙醇-丙酮混合提取法[16]測(cè)定葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素的含量，重復(fù)3次，取其均值，計(jì)算葉綠素a/葉綠素b的值；試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SAS 8.0軟件處理，并進(jìn)行方差分析。

1.3.2 葉片超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察 采集樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定、1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水，Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位、超薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，用電子顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛、鎘脅迫對(duì)馬鈴薯葉片色素含量的影響

鉛、鎘脅迫對(duì)馬鈴薯葉片色素含量的影響情況見(jiàn)表1。由表1可知，在鉛（濃度為1 000 mg/kg）脅迫下，馬鈴薯葉片的葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素合成都受到了抑制，與對(duì)照相比含量都顯著降低（P<0.05），其中葉綠素a含量降低了21.2%，葉綠素b含量降低了28.7%，類(lèi)胡蘿卜素含量降低了34.2%；使葉綠素a/葉綠素b的值略有增大，但與對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明鉛對(duì)馬鈴薯葉片葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的合成具有相當(dāng)?shù)囊种谱饔谩Ｔ阪k（濃度為100 mg/kg）脅迫下，馬鈴薯葉片的葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素合成也受到了抑制，與對(duì)照相比含量也都顯著降低（P<0.05），其中葉綠素a含量降低了39.0%，葉綠素b含量降低了35.4%，類(lèi)胡蘿卜素含量降低了31.4%；使葉綠素a/葉綠素b的值略有降低，但與對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明鎘對(duì)馬鈴薯葉片葉綠素合成具有更強(qiáng)的抑制作用。

2.2 鉛脅迫對(duì)馬鈴薯葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

鉛脅迫下馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，對(duì)照的馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰完整，葉綠體呈圓形或橢圓形，數(shù)量多，在細(xì)胞中所占比例大，并且結(jié)構(gòu)層次分明（圖1-a、圖1-c、圖1-d）；類(lèi)囊體片層清晰，排列有序；線粒體分布均勻，結(jié)構(gòu)緊密（圖1-a、圖1-c），淀粉粒少且小，存在于葉綠體中（圖1-a）；嗜餓顆粒在葉綠體、線粒體中均有分布，但數(shù)量較少（圖1-a、圖1-b、圖1-d）；細(xì)胞壁清晰，平滑致密，細(xì)胞核中核仁顏色清晰，結(jié)構(gòu)完整（圖1-a）。

與對(duì)照相比，經(jīng)鉛（濃度為1 000 mg/kg）脅迫處理30 d后，馬鈴薯葉片超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，其葉綠體腫脹呈圓球形，膜結(jié)構(gòu)模糊，類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)斷裂甚至消失，片層結(jié)構(gòu)顏色變淺，比較分散，排列雜亂無(wú)序（圖1-e、圖1-f）；葉綠體中出現(xiàn)了大而飽滿的淀粉粒，且數(shù)量急劇增加（圖1-e、圖1-f）；嗜餓顆粒形態(tài)大而圓潤(rùn)，所占比例大（圖1-e、圖1-f）；線粒體雙層膜發(fā)生溶解，嵴減少或消失，內(nèi)部空泡化（圖1-g、圖1-h）；細(xì)胞壁增厚，顏色變深，有些甚至出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象（圖1-f、圖1-h），細(xì)胞核核膜破裂，有少量?jī)?nèi)容物流出，核仁顏色變淺（圖1-g）。

2.3 鎘脅迫對(duì)馬鈴薯葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

鎘脅迫下馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化情況見(jiàn)圖2。由圖2可知，對(duì)照的馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰完整，葉綠體呈圓形或橢圓形，數(shù)量多，在細(xì)胞中所占的比例大，并且結(jié)構(gòu)層次分明（圖2-a、圖2-c、圖2-d）；類(lèi)囊體片層清晰，排列有序；線粒體分布均勻，結(jié)構(gòu)緊密（圖2-a、圖2-c），淀粉粒少且小，存在于葉綠體中（圖2-a）；嗜餓顆粒在葉綠體、線粒體中均有分布，但數(shù)量較少（圖2-a、圖2-b、圖2-d）；細(xì)胞壁清晰，平滑致密，細(xì)胞核中核仁顏色清晰，結(jié)構(gòu)完整（圖2-a）。

與對(duì)照相比，鎘（濃度為100 mg/kg）脅迫處理30 d后馬鈴薯葉片的超微結(jié)構(gòu)受到了嚴(yán)重破壞，其葉綠體膜結(jié)構(gòu)完全改變（圖2-e）；片層結(jié)構(gòu)模糊不清，出現(xiàn)了絲狀形態(tài)，造成類(lèi)囊體片層數(shù)量減少，有少量基質(zhì)溢出（圖2-h）；線粒體輕微膨脹呈橢圓形，嵴部分消失，結(jié)構(gòu)解體，數(shù)量變少（圖2-h）；出現(xiàn)巨型淀粉粒，形態(tài)飽滿幾乎充滿整個(gè)葉綠體，所占比例更大（圖2-e、圖2-f、圖2-g、圖2-h）；嗜餓顆粒數(shù)量少，且顏色變淺（圖2-e、圖2-g）；細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁，界限模糊（圖2-f、圖2-h）。

3 小結(jié)與討論

植物受重金屬脅迫的重要特征之一是葉綠素含量下降[17]，試驗(yàn)結(jié)果表明，在鉛（濃度為1 000 mg/kg）脅迫后，馬鈴薯葉片葉綠素的合成受阻，葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著下降（P<0.05）；不過(guò)葉綠素a/葉綠素b的數(shù)值與空白對(duì)照相比無(wú)顯著差異。鎘（濃度為100 mg/kg）脅迫后葉綠素含量也降低，各色素的含量均顯著低于空白對(duì)照（P<0.05），與鉛脅迫處理相比葉綠素含量更低，說(shuō)明馬鈴薯對(duì)鎘更敏感，受到的毒害作用比鉛還要嚴(yán)重，也說(shuō)明馬鈴薯對(duì)鉛有一定的耐受性。葉綠素含量的變化可能是鎘脅迫致使葉片中的鐵含量減少，加上鎘自身對(duì)葉綠素新陳代謝的消極影響，導(dǎo)致葉綠素的降解和生物合成受到累加抑制[18]。

在重金屬鉛、鎘脅迫下，馬鈴薯葉片細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化。鉛脅迫給馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特別是葉綠體、線粒體及膜系統(tǒng)造成了嚴(yán)重傷害，如葉綠體結(jié)構(gòu)改變呈腫脹態(tài)，片層結(jié)構(gòu)變細(xì)變長(zhǎng)出現(xiàn)絲狀形態(tài)，類(lèi)囊體排列紊亂，同時(shí)比空白對(duì)照出現(xiàn)了更多形態(tài)大而飽滿的淀粉粒，嗜餓顆粒大而圓潤(rùn)，二者所占比例增加，線粒體膜部分溶解，細(xì)胞壁增厚，顏色變深，部分發(fā)生質(zhì)壁分離。鎘脅迫后，嵴消失，出現(xiàn)空泡化，內(nèi)部結(jié)構(gòu)解體，失去完整性，葉綠體膜結(jié)構(gòu)大部分被破壞，基粒片層顏色加深，與鉛脅迫相比出現(xiàn)更加飽滿的淀粉粒，而嗜餓顆粒數(shù)量變少、顏色變淺，膜系統(tǒng)破壞明顯，細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁，界限模糊。胡金朝等[19]在研究重金屬脅迫對(duì)植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷中，發(fā)現(xiàn)不同重金屬離子對(duì)植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷效應(yīng)不同，但又存在相似性，以及不同細(xì)胞器對(duì)重金屬的耐受性也存在差異。本試驗(yàn)的結(jié)論與胡金朝等的研究結(jié)果是一致的。

葉綠體和線粒體是細(xì)胞中2個(gè)非常重要的能量轉(zhuǎn)換器，能為馬鈴薯的生長(zhǎng)提供必需的能量，經(jīng)重金屬脅迫后細(xì)胞器功能受到不同程度的損害，這就會(huì)影響馬鈴薯光合作用、呼吸作用等正常運(yùn)行。葉綠體是合成葉綠素的主要細(xì)胞器，細(xì)胞核是遺傳代謝的控制中心，兩者對(duì)馬鈴薯的正常生長(zhǎng)和生理代謝發(fā)揮著重要作用。重金屬對(duì)馬鈴薯葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷是整體性的破壞，因此將葉綠素含量和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化作為衡量重金屬污染后的植物響應(yīng)指標(biāo)之一，可以為研究馬鈴薯對(duì)重金屬的抗性機(jī)理和生理生化機(jī)理提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

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