呂紅英

摘要：通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定美味牛肝菌（Boletus edulis）菌絲體液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件，利用其發(fā)酵液研制出美味牛肝菌液態(tài)菌醋。結(jié)果表明，美味牛肝菌液態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為： 葡萄糖20.0 g、酵母浸出膏5.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB1 0.01 mg；最佳發(fā)酵條件為：pH 5.0、裝液量90 mL、培養(yǎng)溫度26 ℃、振蕩速度180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間6 d。美味牛肝菌液態(tài)菌醋的最優(yōu)配方為：發(fā)酵液50%、檸檬酸0.20%、穩(wěn)定劑0.18%、甜味劑0.15%。

關(guān)鍵詞：美味牛肝菌（Boletus edulis）；液態(tài)發(fā)酵；醋

中圖分類號(hào)：S646.3；TS264.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-4026-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.050

The Preparation of the Liquid Fermentation Vinegar of Boletus edulis

LV Hong-ying

（College of Bioengineering， Jilin Agricultural Science and Technology College， Jilin 132101，Jilin， China）

Abstract：Optimize the conditions of liquid fermentation for mycelium of Boletus edulis by single factor test and orthogonal test. Developed using fermented liquid porcini of B. eduli. The results showed that： the optimal conditions of liquid fermentation of B. edulis： Glucose20.0 g， yeast extract 5.0 g， KH2PO4 3.0 g，MgSO·7H2O1.5 g， VB1 0.01 mg.The optimum culture conditions were： the value of pH was 5.0， the volume of liquid 90 mL ， culture temperature of 26 ℃， the oscillation velocity 180 r/min， cultiva tiontime 6 d. The optimal formula for liquid vinegar bacteria of B. edulis was： fermentation liquid 50%， citric acid 0.20%， stabilizer 0.18%， sweetener 0.15%.

Key words：Boletus edulis； liquid fermentation； vinegar

釀造醋不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分還具有天然、營(yíng)養(yǎng)、保健等特性[1]。中國(guó)民間也流傳著許多以食醋為主或?yàn)檩o治療疾病的藥方[2]。食醋不僅有抗菌、緩解疲勞、降血脂、降低血清中的膽固醇含量、預(yù)防和治療糖尿病等功效，而且還有抗氧化、抗衰老、美容、解酒保肝等作用[3，4]。

食用菌是能夠形成大型肉質(zhì)或膠質(zhì)的子實(shí)體或菌核類組織，并能供人們食用或藥用的一類大型真菌[5]，不僅味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、維生素、抗生素、核苷酸等物質(zhì)，能調(diào)節(jié)人體新陳代謝，增強(qiáng)體質(zhì)，被譽(yù)為“人類植物性食品營(yíng)養(yǎng)的頂峰”[6]，是深受大眾喜愛(ài)的健康食品。為了豐富食品種類，提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，可以將食用菌應(yīng)用到食品工業(yè)中，其中食用菌發(fā)酵菌醋就是一種有效的途徑。美味牛肝菌（Boletus edulis）又名大腳菇，屬于擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目牛肝菌科中的一種[7]，是一種世界范圍內(nèi)分布的食藥兼用經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的真菌，中國(guó)各省均有分布，尤其西南地區(qū)產(chǎn)量較高[8]，且全世界已知的牛肝菌屬已有1 024種，中國(guó)已知的可食用的就有199種[9]。美味牛肝菌的肉質(zhì)肥厚而細(xì)嫩、香味濃郁、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，美味牛肝菌含有多種生物堿可治腰腿疼痛、手足麻木、盤骨不舒、四肢抽搐以及婦女白帶異常等癥[9，10]，具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。經(jīng)常食用牛肝菌可明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善機(jī)體微循環(huán)。本試驗(yàn)旨在利用美味牛肝菌的營(yíng)養(yǎng)功效研發(fā)液態(tài)發(fā)酵菌醋的生產(chǎn)工藝，拓寬其利用范疇。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：美味牛肝菌，釀酒干酵母，醋酸菌。

儀器：電子天平、真空抽濾裝置、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、手持糖量計(jì)等。

1.2 工藝流程

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將美味牛肝菌種用接種針接到斜面培養(yǎng)基中，于25 ℃活化培養(yǎng)5 d，待菌絲體長(zhǎng)滿斜面[5]，備用。

1.3.2 液體種子培養(yǎng) 將活化的美味牛肝菌用接種針從斜面接入到液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃，150 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d。

1.3.3 液體發(fā)酵培養(yǎng) 將種子培養(yǎng)液按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后得到發(fā)酵液。

1.3.4 菌絲體生物量測(cè)重方法 用雙層紗布過(guò)濾即分離得到菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液備用，將菌絲體用去離子水沖洗3次再用濾紙吸至不滴水，用電子天平稱重。

1.3.5 補(bǔ)料 向上述美味牛肝菌發(fā)酵液中補(bǔ)充已滅菌的20%蔗糖溶液，將其可溶性固形物含量調(diào)整為9%～10%。

1.3.6 酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵 將補(bǔ)料后的美味牛肝菌發(fā)酵液100 mL裝入250 mL三角瓶中，接入預(yù)先活化好的酵母菌，接種量10%，均勻攪拌，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待酒精含量達(dá)到5%～6%時(shí)停止酒精發(fā)酵。向酒精發(fā)酵后的成熟的酒醪中接入醋酸菌培養(yǎng)液，在28～32 ℃下進(jìn)行醋酸發(fā)酵，醋酸發(fā)酵過(guò)程中每日攪拌2～3次，并隨時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液中醋酸和酒精的含量變化。當(dāng)酸度不再增加，酒精含量達(dá)到最小即到達(dá)醋酸發(fā)酵終點(diǎn)。

1.3.7 加鹽淋醋、澄清過(guò)濾 醋醅成熟后及時(shí)加入8%～10%食鹽抑制醋酸菌的活性，防止成熟醋醅發(fā)生過(guò)度氧化，降低醋酸產(chǎn)量。先將一半食鹽放入醋醅上拌勻，另一半食鹽撒在醋醅表面，第二天翻醅1次，接著再翻醅，1～2 d即可進(jìn)行淋醋，采用套淋法循環(huán)泡淋。然后將上述發(fā)酵液用4層紗布進(jìn)行粗濾之后加入殼聚糖澄清，用真空泵進(jìn)行抽濾， 即得澄清透明的美味牛肝菌醋原液。

1.3.8 調(diào)配 量取飲用水和蜂蜜（作為風(fēng)味成分，添加量4%，添加過(guò)多會(huì)增加成品飲料中糖的含量），然后對(duì)發(fā)酵液量、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、檸檬酸等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定單因素對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響，然后進(jìn)行正交試驗(yàn)，以期獲得最佳配方工藝[11-14]。

1.3.9 裝瓶、滅菌、陳釀、成品檢驗(yàn) 定量裝瓶封蓋，裝瓶后，立即用巴氏消毒法進(jìn)行滅菌，密封陳釀20～30 d左右，即得成品美味牛肝菌保健醋。對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官檢驗(yàn)[15]、理化檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)，各項(xiàng)指標(biāo)都符合飲料行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)即為成品。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

2.1.1 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以蛋白胨2.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 0.01 mg為單因子基礎(chǔ)培養(yǎng)基[16]，分別以20.0 g的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇和可溶性淀粉作碳源試驗(yàn)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，確定對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)影響的最優(yōu)碳源。圖1結(jié)果表明，美味牛肝菌對(duì)試驗(yàn)中所用碳源均可利用，既能利用成分復(fù)雜的復(fù)合碳源，也能利用單糖和雙糖等小分子碳源，所試碳源中以葡萄糖最好，菌絲體生物量達(dá)121 g/L，菌絲生長(zhǎng)快，菌絲球小，均勻，密度高。所以綜合不同碳源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響，以葡萄糖為最適碳源。

2.1.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 0.01 mg為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以5.0 g的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出膏、硫酸鎂、麩皮和水解乳蛋白作氮源試驗(yàn)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定不同氮源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。圖2結(jié)果表明，在不同的氮源培養(yǎng)基中菌絲體生物量有所不同。其中以酵母浸出膏作為氮源時(shí)，菌絲生物量最高，并且菌絲球大小均勻。所以綜合不同氮源對(duì)美味牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響，以酵母浸出膏為最適氮源。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果表明，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20.0 g，酵母浸出膏5.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 0.01 mg。

2.2 發(fā)酵條件的選擇

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將接種搖瓶分別置于18、22、26、30 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后，測(cè)定培養(yǎng)溫度對(duì)美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響（表1）。結(jié)果表明，溫度對(duì)美味牛肝菌的生長(zhǎng)十分重要，在受試的18～30 ℃菌絲均能生長(zhǎng)。但是在較低溫度和較高溫度下菌絲生長(zhǎng)都不是很好，只有在26 ℃菌絲最好，菌絲體生物量高，且合適的溫度能縮短發(fā)酵時(shí)間。因此，菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)溫度為26 ℃。

2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 250 mL三角瓶裝入90 mL培養(yǎng)液，26 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響（表2）。由表2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體含量逐漸增加，但發(fā)酵前期菌絲體生物量增加迅速，第五天出現(xiàn)了大量菌絲球，發(fā)酵液變得透明，第六天菌絲體生物量達(dá)到較大值。從第七天再繼續(xù)培養(yǎng)，雖然菌絲體也在增加，但菌絲體生物量增加幅度相對(duì)緩慢。而隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本增加幅度較大，因此，綜合產(chǎn)品質(zhì)量因素及經(jīng)濟(jì)因素，菌絲生長(zhǎng)的最適發(fā)酵周期確定為6 d。

2.2.3 pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)液pH分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接斜面菌種1.0 cm2、26 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后，測(cè)定pH對(duì)美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響（表3）。由表3可知，美味牛肝菌在偏酸的環(huán)境下生長(zhǎng)較好，菌絲體生物量比較高，且該pH與培養(yǎng)基的自然pH 5.0相近。綜合培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的最適pH為5.0～5.5。

2.2.4 振蕩速度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 250 mL三角瓶于26 ℃條件下分別處于90、120、150、180、210 r/min振蕩速度培養(yǎng)6 d后，測(cè)定振蕩速度對(duì)美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響（表4）。由表4可知，食用菌液體搖瓶培養(yǎng)的菌絲生物量顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)基或液體靜置培養(yǎng)基，在一定范圍內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)速的增大，通氣量增大，菌絲球數(shù)量增多，有利于菌絲的生長(zhǎng)；在轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min時(shí)菌絲生物量最大，但當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到210 r/min時(shí)，菌絲生長(zhǎng)開(kāi)始下降，因此，美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的最適振蕩速度為180 r/min。

2.2.5 裝液量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 250 mL的三角瓶中分別選擇50、60、70、80、90、100、110、120 mL裝液量，26 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后，測(cè)定裝液量對(duì)美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響（表5）。由表5可知，菌絲體生物量與裝液量呈正相關(guān)，隨著裝液量的增加，菌絲體生物量也增多；裝液量少，菌絲體生物量也少，培養(yǎng)基利用率也不高，但裝液量超過(guò)90 mL時(shí)，由于搖瓶供氧不足，菌絲生物量的增加幅度降低。因此，美味牛肝菌絲生長(zhǎng)的最適裝液量確定為90 mL。

2.3 發(fā)酵條件綜合試驗(yàn)

通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH、振蕩速度、培養(yǎng)溫度、裝液量及培養(yǎng)時(shí)間5個(gè)因素，設(shè)計(jì)3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)， 以菌絲體干重為參考指標(biāo)，確定最優(yōu)發(fā)酵條件（表6）。由表6的極差R的大小可知，A>D>C>B>E即各因子重要性的順序?yàn)椋簆H>裝液量>培養(yǎng)溫度>轉(zhuǎn)速>培養(yǎng)時(shí)間，發(fā)酵的最優(yōu)搭配組合為A2B2C3D3E2，即pH 5.0、裝液量90 mL、培養(yǎng)溫度26 ℃、振蕩速度180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間6 d來(lái)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，有利于美味牛肝菌在發(fā)酵罐中產(chǎn)生大量的菌絲體，且發(fā)酵液香味清純。

2.4 菌醋配方的設(shè)計(jì)

2.4.1 發(fā)酵液對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響 采用檸檬酸的添加量為0.2%、穩(wěn)定劑（黃原膠）的添加量為0.2%、甜味劑（甜菊糖苷）的添加量為0.05%～0.15%的基礎(chǔ)上分別加入30%、40%、50%、60%、70%的發(fā)酵液配制飲料（表7）。由表7可知，當(dāng)發(fā)酵液的添加量從30%增加到50%時(shí)，產(chǎn)品品質(zhì)越來(lái)越好。當(dāng)發(fā)酵液的添加量繼續(xù)增加，發(fā)酵液對(duì)發(fā)酵飲料的品質(zhì)影響較小，甚至停止。

2.4.2 甜味劑的選用及用量 甜菊糖苷作為一種常用的甜味劑，其用量直接影響著發(fā)酵飲料的風(fēng)味，需要嚴(yán)格控制用量，是調(diào)配過(guò)程中應(yīng)特別注意的步驟。在發(fā)酵液的添加量為50%，檸檬酸的添加量為0.2%，穩(wěn)定劑（黃原膠）的添加量為0.2%的基礎(chǔ)上分別加入0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的甜菊糖苷配制飲料。由表8可知，甜菊糖苷的添加量在0.05%～0.15%時(shí)品質(zhì)較好，比較合適大眾口味。

2.4.3 檸檬酸對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響 在發(fā)酵液的添加量為50%，穩(wěn)定劑（黃原膠）的添加量為0.2%，甜味劑（甜菊糖苷）的添加量為0.05%～0.15%的基礎(chǔ)上分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的檸檬酸配制飲料。由表9可知，當(dāng)檸檬酸的添加量為0.2%時(shí)發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)最好，當(dāng)其量超過(guò)0.2%后，發(fā)酵飲料的酸味越來(lái)越大，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)。

2.4.4 穩(wěn)定劑的選擇 通過(guò)前期試驗(yàn)對(duì)黃原膠、果膠、明膠、CMC等穩(wěn)定劑進(jìn)行對(duì)比選擇試驗(yàn)后，確定黃原膠穩(wěn)定效果最好，需對(duì)黃原膠的用量進(jìn)一步確定。在發(fā)酵液的添加量為50%，檸檬酸的添加量為0.2%，甜味劑（甜菊糖苷）的添加量為0.05%～0.15%的基礎(chǔ)上分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的穩(wěn)定劑（黃原膠）配制飲料。由表10可知，當(dāng)穩(wěn)定劑的添加量達(dá)到0.2%時(shí)，發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)最好，且不會(huì)出現(xiàn)沉淀，而超過(guò)0.2%后穩(wěn)定劑會(huì)使發(fā)酵飲料中的可溶性固形物產(chǎn)生沉淀，從而影響感官品質(zhì)。

2.5 發(fā)酵飲料配方的綜合試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)的3個(gè)水平，按L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)最佳配方。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表11，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。由表12可知，A>D>C>B，即發(fā)酵液對(duì)發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響顯著，檸檬酸、穩(wěn)定劑、甜味劑對(duì)發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響均不顯著，因素影響主次順序?yàn)榘l(fā)酵液>穩(wěn)定劑>檸檬酸>甜味劑，試驗(yàn)時(shí)可選取最佳水平為A2B3C2D2，即發(fā)酵液50%、檸檬酸0.20%、穩(wěn)定劑0.18%、甜味劑0.15%時(shí)，感官評(píng)分最高，發(fā)酵飲料品質(zhì)最好。

3 結(jié)論

以美味牛肝菌為研究對(duì)象，從菌種的活化、培養(yǎng)、發(fā)酵及發(fā)酵飲料配方的設(shè)計(jì)等方面進(jìn)行研究。先對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得出最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母浸出膏，然后對(duì)發(fā)酵條件的選擇進(jìn)行正交試驗(yàn)，得出最佳發(fā)酵條件為：pH 5.0、裝液量90 mL、培養(yǎng)溫度26 ℃、振蕩速度180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間6 d，最后進(jìn)行發(fā)酵飲料配方的正交試驗(yàn)得到發(fā)酵飲料的最優(yōu)配方為：發(fā)酵液50%、檸檬酸0.20%、穩(wěn)定劑0.18%、甜味劑0.15%。試驗(yàn)采用食用菌液態(tài)發(fā)酵的方法，制得更加優(yōu)化的發(fā)酵液，并對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行食品開(kāi)發(fā)，經(jīng)后期調(diào)配降低酸度，并添加甜味物質(zhì)制成的美味牛肝菌保健醋飲料，風(fēng)味獨(dú)特， 酸甜可口， 富含多種生物活性物質(zhì)， 具有十分廣闊的市場(chǎng)前景。

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