孫杰，陳發(fā)榮*，韓力揮，李景喜，陳軍輝，鄭立，王小如

（1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，山東青島266100；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

不同海星中微量元素的主成分分析及聚類分析

孫杰1，2，陳發(fā)榮*1，2，韓力揮1，李景喜1，2，陳軍輝2，鄭立2，王小如2

（1.中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，山東青島266100；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

建立了微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定海星樣品中Cr、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Cd和Pb元素含量的實驗方法，對我國山東、遼寧和江蘇等7個省份海星樣品中微量元素的含量進行了測定，并運用SPSS11.5對實驗數(shù)據(jù)進行了主成分分析和聚類分析。結(jié)果表明海星中Cd和Cr的平均含量均超出了我國食品安全限量標準值（GB2762-2012）。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，前3個主成分累積方差貢獻率超過60%，得出Zn、Se、Ni和As為海星的特征性元素，并且對特征性元素人體攝入量進行了初步分析。同時利用特征性元素對所測樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當歐式距離為25.0時，所測樣品聚為海燕和海盤車兩大類，依照此類聚類分析方式，樣品還可以聚為5大類和8大類，通過分析結(jié)果表明聚類依據(jù)大部分取決于海星的品種。

電感耦合等離子體質(zhì)譜法；海星；微量元素；主成分分析；聚類分析

海星屬于棘皮動物門海星綱，在我國共有100多種海星主要分布于浙江、福建、廣東和南沙群島等沿海地區(qū)，海星作為一種中藥物質(zhì)具有和胃止痛、制酸和止瀉等作用［1-3］，從海星中能夠分離出的化學成分主要有皂苷、多糖和膠原蛋白等，可見海星具有良好的開發(fā)價值和經(jīng)濟效益。眾所周知，微量元素也是中藥藥效物質(zhì)的重要組成部分，對人體內(nèi)大多活性物質(zhì)都具有一定的調(diào)控作用［4］。然而微量元素含量過多也會對人體產(chǎn)生負面作用。目前，國內(nèi)外學者對海星中微量元素的研究手段主要包括原子吸收光譜儀（AAS）［5］和原子發(fā)射光譜儀（AES）［6］，電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）是近些年新興起的測試手段［7-8］，它具有檢出限低、線性范圍寬、準確、快速、多元素同時分析等特點［9-10］。

現(xiàn)階段ICP-MS法與國家標準測定法進行反復對比測試階段［11］，作者應用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定了7個產(chǎn)地的海星中9種微量元素的含量，所測得元素為人們所關注的有毒元素和有益元素，并運用SPSS11.5對不同產(chǎn)地的海星中微量元素進行主成分分析和聚類分析，對7個產(chǎn)地的海星的含量差異、特征性元素和分布特征進行了研究，為ICP-MS作為新國家標準的制定和海星的進一步開發(fā)與研究提供了理論基礎。

1　材料與方法

1.1實驗樣品

海星樣品為各產(chǎn)地采購所得，實驗所用海星樣品的輻徑均在20～30 cm，具體信息見表1。將所有海星樣品，分別取其內(nèi)質(zhì)用兩次蒸餾水進行清洗，，在-80℃的超低溫冰箱中冷凍12 h，然后在冷凍干燥機中進行冷凍干燥24 h，粉碎，過80目篩，分別裝入50 mL的聚乙烯瓶中，放入干燥器中保存，待用。

表1　實驗所用海星樣品Table 1Starfish samples in experiment

1.2主要儀器與試劑

7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：安捷倫公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機：LABCONCO公司產(chǎn)品，MARS微波消解儀：CEM公司產(chǎn)品，Milli-Q超純水處理系統(tǒng)：Milipore公司產(chǎn)品。

7Li、89Y、205Tl、140Ce的調(diào)諧溶液：美國，安捷倫公司產(chǎn)品；6Li、45Sc、72Ge、89Y、115In、159Tb、209Bi的內(nèi)標溶液：安捷倫公司產(chǎn)品，使用前用質(zhì)量分數(shù)5%的硝酸稀釋到1 mg/L。所用標準物質(zhì)為國家黃魚標準物質(zhì)（GBW08573）。

1.3儀器的工作條件

ICP-MS工作條件：分析模式為定量分析；射頻功率為1 360 W；采樣錐為鉑錐；采樣深度為6.0 mm；等離子體氣流量為15.0 L/min；載氣流量為1.24 L/min；輔助氣流量為1.0 L/min；霧化室溫度為2.0℃；積分時間為0.3 s；采集次數(shù)為3次；分析測試前用10 μg/L的7Li、89Y、205Tl、140Ce的調(diào)諧液對ICP-MS進行調(diào)諧，使儀器的靈敏度、雙電荷、氧化物干擾、分辨率達到分析測定要求。

微波消解儀的工作條件：第一次升溫到100℃，升溫時間為10 min，運行功率為800 W，100℃狀態(tài)下維持時間為5 min。第二次升溫至150℃，升溫時間10 min，運行功率為800 W，150℃狀態(tài)下維持時間5 min。第三次升溫至190℃，升溫時間為12min，運行功率為800W，190℃狀態(tài)下維持10min。

1.4樣品中微量元素的測定

準確稱量待用海星樣品0.3 g，每個樣品做3份平行實驗，分別轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯的消解罐中，同時加入6 mL濃硝酸溶液并放置一夜，接著加入2 mL雙氧水溶液放置1 h之后，放入微波消解儀中進行消解，并按照微波消解儀的工作條件運行。過0.45 μm的濾器膜，用ICP-MS測定，同時每批樣品做3份空白實驗和3份黃魚標準樣品實驗。

2　結(jié)果與分析

2.1儀器干擾校正和檢出限實驗

7500a型ICP-MS的干擾一般包括非質(zhì)譜干擾與質(zhì)譜干擾，非質(zhì)譜干擾由于樣品的基體效應引起的，通過使用質(zhì)量分數(shù)2%的硝酸稀釋100倍以降低樣品的基體濃度和在線加入1 μg/g的多元素內(nèi)標溶液等方法進行消除這類干擾。同時在每次分析中進行觀測所有內(nèi)標溶液元素的強度，如果內(nèi)部標準溶液中的任何一個元素的強度降低到初始強度的70%，必須到考慮基體效應的影響。質(zhì)譜干擾一般包括同質(zhì)異位素和氧化物離子等干擾以及雙電荷離子干擾，實驗中75As主要受75Ar的干擾、40Ar、38Ar會對78Se造的干擾，均可借助于EPA200.8干擾校正方程進行校正進行消除這類質(zhì)譜干擾。

通過使用0，0.01，0.02，0.05，0.1 μg/g的多元素混合標準系列建立標準曲線，同時連續(xù)進樣11次空白樣品，進行方法檢出限的測定（見表2）。表2表明9種元素的線性較好，各元素測定相關性系數(shù)r＞ 0.999 5，檢出限較低。

表2　儀器方法的檢出限、線性方程、線性相關系數(shù)Table 2Summary of analyte masses，standard curve，LOD for study elements

2.2樣品消解過程分析和準確度以及精確度實驗

國內(nèi)文獻一直在探討樣品消解方法［9-10］，最終許多文獻表明HNO3-H2O2為最佳體系，但是經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)若同時加入HNO3-H2O2進行預消解，會造成As、Se等元素產(chǎn)生不同程度地損失，消解時間過短或者消解時間過程均會造成此類元素的消解不徹底或者揮發(fā)，消解方式既保證了樣品消解的徹底，也避免了As、Se等此類元素的揮發(fā)損失。

考慮到實際樣品基體的復雜性和多樣性，為了驗證實驗方法的準確性，實驗首先對國家標準黃魚物質(zhì)（GBW08573）進行測定。通過表3可以看出RSD＜5%，標準物質(zhì)的回收率為86%～113%，說明本方法準確可靠、重現(xiàn)性好，可以滿足海星樣品中微量元素的測定。

表3　測定國家標準物質(zhì)（GBW08573）黃魚中元素總質(zhì)量分數(shù)（μg/g，n=3）Table 3Determination of total Concentration of element in National material Croaker（GBW08573）（μg/，n=3）

2.3樣品中微量元素含量的測定

按照本次實驗方法對7個產(chǎn)地12批海星樣品中Cr、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Cd和Pb元素的含量進行了測定，測定結(jié)果列于表4。

表4　海星中9種微量元素的測定結(jié)果（μg/g，n=3）Table 4Determined values of 9 kinds of trace elements in starfish（μg/g，n=3）（μg/g）

從測定結(jié)果可以看出所測定的不同元素的含量相差較大，同一種元素在不同產(chǎn)地的海星中含量也存在著較大區(qū)別，在所測定的9種不同微量元素中最大質(zhì)量分數(shù)平均值為41.21 μg/g，最小含量平均值為0.96 μg/g。通過與《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB2762—2012）中重金屬元素的限量值（Cd≤2.00 μg/g，Cr≤2.00 μg/g，Pb≤1.00 μg/g）進行比較，結(jié)果表明海星中Cd和Cr的平均含量均超出限量標準值，而Pb元素的平均含量低于限量標準值。

2.4主成分分析

由表4可見，7個不同產(chǎn)地海星中微量元素的含量數(shù)據(jù)繁多且雜亂，主成分分析是在不丟掉原來主要信息的前提下，從多個指標之間的相互關系入手，利用降維的思想，將原來多個指標組合成少數(shù)指標，運用SPSS11.5軟件對所測數(shù)據(jù)進行主成分分析，結(jié)果見表5和表6。

表5　主因子的特征值和方差貢獻率Table 5Eigenvalues and variance of the main factors in the contribution rate

表5表明前3個因子的累積方差貢獻率達到80.56%，故選定前3個因子對樣品信息進行概括。表6是經(jīng)方差極大法對因子載荷矩陣旋轉(zhuǎn)后的結(jié)果。從表6可以看出主成分1中的Ni元素和主成分2中的Zn、Se元素以及主成分3中的Pb元素載荷系數(shù)較大，對其貢獻較多，故可確定Zn、Se、Ni和Pb元素為海星的特征性元素。

表6　經(jīng)旋轉(zhuǎn)的主成分矩陣Table 6Rotated principal component matrix

2.5特性元素與人體攝入量的初步分析

特征元素中Zn、Se、Ni和Pb公認為人體所必需的微量元素［12］，而As元素被公認為有害元素。其中Zn元素對促進機體生長發(fā)育，維持細胞功能和調(diào)節(jié)機體免疫具有重要作用，正常成年人Zn元素的攝入量約為15～20 mg，如果Zn元素攝入量不足或者缺乏，容易引起生長發(fā)育遲緩和智力發(fā)育產(chǎn)生障礙。Se元素既能激活細胞免疫中淋巴細胞，又能刺激免疫球蛋白及抗體產(chǎn)生，Se元素的日常吸收量約為50～200 μg，如果Se元素缺乏或者過剩都會影響人體健康。Ni元素能刺激生血機和胰島素增加，如果缺Ni容易引起皮炎和支氣管炎，人體每日需要攝入Ni的量為0.6 mg左右。此外，Pb元素及其化合物皆有毒，能引起起許多器官系統(tǒng)的紊亂，例如血液和神經(jīng)系統(tǒng)更為突出。可導致頭暈、頭痛、無力、關節(jié)痛、貧血、記憶力減退神經(jīng)衰弱等癥狀，人體Pb元素日常最高吸收量為30 μg。

2.6聚類分析

將所測定的樣品中4種特征性元素作為變量，采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對樣品進行系統(tǒng)聚類分析（離差平方和法，Wards Methods），運用歐氏距離作為樣品的測度，縱坐標為樣品編號，具體見圖1。

圖1　12種海星樣品的聚類樹狀圖Fig.1Dendrogram of 12 species of starfish samples

上述分類結(jié)果表明當歐式距離為25.0時，36個海星樣品聚為兩大類，3個廣州海燕聚為一類，其余33樣品聚為一類。當歐式距離為7.5時，樣品聚為3大類，3個廣州海燕單獨聚為一類，3個海南?？诘拇肘g海盤車和3個廣州的羅氏海盤車以及1個海南海口的窄花海星樣品聚為一類，其余25個樣品聚為一類。當歐氏距離為5.0時，結(jié)合海星分為海燕和海盤車兩大類實際情況以及本次樣品的實際情況，結(jié)果表明海燕與海盤車類的樣品分離率為100%，而海燕樣品內(nèi)部分離率為66.67%，可以說明海燕能與海盤車類樣品完全分離開。按照這類聚類分析方式，樣品還可以聚為5大類和8大類，當聚為8大類時，包括了1個河北和1個海南的光滑花海星樣品聚為一大類，2個河北和3個廣西的光滑花海星樣品聚為一大類，以上分析結(jié)果表明7個產(chǎn)地的海星樣品聚類分析最主要的依據(jù)是品種的不同，而不是產(chǎn)地的原因，所以在海星的選擇方面更需要考慮品種的區(qū)別。

3　結(jié)語

通過研究不同海星樣品中9微量元素的含量，同時確定海星樣品的特征性元素及分布特征，表明海星中Cd和Cr的平均含量均超出限量標準值，而Pb元素的平均含量低于限量標準值，通過主成分分析得出了Zn、Se、Ni和Pb為海星的特征性元素。

運用特征性元素對所測樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當歐式距離為25.0時，36個樣品聚為海燕和海盤車兩大類，依照此類分析方式，36個樣品還可以聚類為5大類和8大類，聚類的最重要依據(jù)是品種的差別，為海星的進一步開發(fā)研究提供了理論依據(jù)。

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Principal Component Analysis and Clustering Analysis of Trace Elements in Different Asteroidea

SUN Jie1，2，CHEN farong*1，2，HAN Lihui1，LI Jingxi1，2，CHEN Junhui2，ZHENG Li2，WANG Xiaoru2
（1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266100，China；2.First Research Institute of State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China）

The paper set up a new method to determine the concentrations of trace elements in Starfish samples in 7 different places The samples digested by microwave digestion，and trace elements amounts of Cr，Co，Ni，Cu，Zn，As，Se，Cd and Pb in samples solutions were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry（ICP-MS）.The principal components analysis and cluster analysis of SPSS11.5 were applied to the study of experiment data.The result showed that the average concentrations of Cd and Cr in Starfish samples were more than those national limited values（GB2762-2012），Besides，the principal component analysis showed that three principal components accounted for more than 60%，and Zn，Se，Ni and As were characteristic elements in Starfish samples.In addition，It also preliminarily analyzed human intake of characteristic elements，According to those characteristic elements，the result of clustering analysis showed that the samples could be reasonably clustered into two groups，including swallow and starfish，when the Euclidean distance was 25.0.These samples could also be divided into five categories and eight categories by such analysis methods.The analyzed result showed that the clustering analysis was partly based on the difference in varieties.Therefore，it was more important to consider genetic reasons while choosing Starfish，The research provided the development and utilization of Starfish with important information.

ICP-MS，Asteroidea，trace elements，principal components analysis，cluster analysis

O 655.11

A

1673—1689（2015）10—1051—06

2014-10-23

科技部基礎性工作專項（2008FY230600）；青島市公共領域科技支撐計劃項目（12-1-3-82-jh）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目（2014G13）。

陳發(fā)榮（1978—），男，福建龍巖人，助理研究員，主要從事微量元素及其形態(tài)研究。E-mail：frchen@fio.org.cn