鄭曉吉，王順利，史學(xué)偉，單春會*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆唐庭霞露酒莊有限公司，新疆五家渠831300）

新疆第六師葡萄產(chǎn)區(qū)酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵特性研究

鄭曉吉1，王順利2，史學(xué)偉1，單春會*1

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆唐庭霞露酒莊有限公司，新疆五家渠831300）

從新疆第六師葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄表皮、葡萄園土壤和自然發(fā)酵的葡萄醪中共分離出127株酵母菌。經(jīng)過初篩、復(fù)篩和綜合耐受性試驗，獲得一株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌株F12。通過糖發(fā)酵、碳氮源同化試驗并結(jié)合菌落特征、細(xì)胞形態(tài)，以及5.8SrDNA ITS區(qū)基因序列測序，鑒定F12屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株F12生長繁殖快、發(fā)酵力強，酵母絮凝性良好，對葡萄汁具有較強的適應(yīng)能力，能在10～35℃、含糖＞400 g/L、SO2含量＞200 mg/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)＞15%、含酸量＞18 g/L的葡萄汁中發(fā)酵。以F12釀制的葡萄酒具有色澤純正，葡萄酒香氣濃郁，口感醇厚，酒體協(xié)調(diào)，無雜味的特點，具有典型的風(fēng)格。

新疆；小產(chǎn)區(qū)；葡萄酒酵母；篩選；鑒定

新疆獨特的氣候特點決定了其在葡萄酒行業(yè)的優(yōu)勢。新疆地區(qū)高熱、少雨、日照時間長，使釀酒葡萄著色深、糖度高，適宜于釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒。目前，新疆釀酒葡萄種植面積達(dá)32萬畝，主要分布在天山北坡和焉耆盆地［1-2］。新疆天山北麓地區(qū)特定的氣候適宜葡萄的生長，是新疆葡萄優(yōu)良的產(chǎn)區(qū)。多年種植葡萄的園區(qū)有多種天然酵母與其相伴而生，經(jīng)長期的自然選擇和進(jìn)化演變，逐漸孕育了一批適于當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件和葡萄品種的優(yōu)勢天然酵母菌群，可從中篩分優(yōu)良葡萄酒酵母，有可能釀制出具有地域特色和獨特風(fēng)格的產(chǎn)地葡萄酒［2］。

目前新疆葡萄酒生產(chǎn)中多采用進(jìn)口的活性干酵母，葡萄酒產(chǎn)品產(chǎn)區(qū)風(fēng)格特征不明顯。針對新疆葡萄產(chǎn)區(qū)及其主栽品種，選育適合特定產(chǎn)區(qū)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的專用釀酒酵母，突出產(chǎn)區(qū)葡萄酒產(chǎn)品風(fēng)格特征，經(jīng)濟(jì)意義重大。作者對新疆第六師主要的葡萄產(chǎn)區(qū)不同品種葡萄及土壤中優(yōu)勢釀酒酵母進(jìn)行分離、篩選和鑒定，為選育具有地域特色小產(chǎn)區(qū)葡萄酒專用酵母菌，提高新疆葡萄酒品質(zhì)打下重要基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要試劑用于PCR擴增的全套試劑及擴增引物：寶生物工程大連（TaKaRa）有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物純化試劑盒：加拿大Bio Basic Inc.公司產(chǎn)品；相關(guān)生理生化試驗所用試劑：天津市巴斯夫化學(xué)試劑廠及上海生工產(chǎn)品。

1.1.2培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基（YM培養(yǎng)基g/L）：酵母浸膏3，麥芽浸膏3，蛋白胨5，葡萄糖20，瓊脂20，pH 6.2，氯霉素100 mg/L。基礎(chǔ)培養(yǎng)基（YEPD培養(yǎng)基g/L）：麥芽浸膏30，蛋白胨0.5，瓊脂15，pH 5.6。

1.2儀器與設(shè)備

GC/MS：美國Finnigan產(chǎn)品；Trace Fresco21高速冷凍離心機：美國Thermo公司產(chǎn)品；Tprofessional PCR儀：德國Biometra公司產(chǎn)品；Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng)：BioRad公司產(chǎn)品；170-8720icycler定量基因擴增儀：美國BioRad公司產(chǎn)品；WTO-80型手持折光儀：成都泰華光學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.3葡萄酒酵母菌的分離與純化

在新疆第六師主要葡萄種植區(qū)采摘新鮮成熟的葡萄，多點采集葡萄園土樣進(jìn)行酵母菌分離。不同樣品制成不同濃度梯度菌液，吸取100 μL涂布在YM固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～3 d，挑取形態(tài)各異、大小不一的典型酵母菌菌落，然后再次劃線接種于YM培養(yǎng)基上，重復(fù)純化2～3次［3-4］。

1.4葡萄酒酵母菌的初篩和復(fù)篩

活化保藏菌種，取一環(huán)待測菌株接種于裝有20 mL滅菌葡萄汁的大試管（內(nèi)有杜氏發(fā)酵管），28℃下恒溫培養(yǎng)。采用杜氏管法測試被篩菌株的發(fā)酵性能，被測指標(biāo)包括發(fā)酵力、起酵時間、凝聚性、發(fā)酵氣味。

將初篩菌株種子液按體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入700 mL新鮮葡萄汁（含100 mg/L的SO2），28℃恒溫培養(yǎng)。發(fā)酵過程中每隔12 h稱重一次，直到24 h失重小于0.2 g時，停止發(fā)酵，同時做空白實驗。測定指標(biāo)有總酸、總糖、酒精度、發(fā)酵力、凝聚性、產(chǎn)酒香氣。

1.5葡萄酒酵母菌的耐酒精、耐SO2、耐酸試驗、耐糖試驗

葡萄酒酵母菌綜合耐受性試驗參照徐艷文［5-6］和王慧［7］的方法。

1.6優(yōu)勢葡萄酒酵母菌分子生物學(xué)鑒定

1.6.1酵母菌DNA的制備參考Makimura et al［8］方法提取菌株總DNA。

1.6.2酵母菌5.8S rDNA-ITS區(qū)基因的PCR擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用酵母菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3’）對5.8S rDNA ITS區(qū)基因片段進(jìn)行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用EZ-10柱純化后根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，通過Clustal X和MEGA3.1軟件進(jìn)行對比分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［8-12］。

1.7GC-MS測定葡萄酒揮發(fā)性成分：

GC-MS分析條件：采用DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為99.999%氦氣，流量1.8 mL/min。色譜柱初始溫度為40℃，3 min，以6℃/min升溫至80℃，再以10℃/min升溫至230℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：電離方式為EV，電子能量70 eV，離子源溫度為230℃，燈絲發(fā)射電流為35mA，接口溫度為250℃，掃描質(zhì)量范圍為35～450。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄酒酵母菌的初篩和復(fù)篩結(jié)果

將分離得到127株酵母菌，采用杜氏管法測試菌株的發(fā)酵性能，評價指標(biāo)有發(fā)酵力、起酵時間、凝聚性、發(fā)酵氣味。根據(jù)試驗結(jié)果從127株酵母菌中初篩出發(fā)酵性能良好的7株酵母菌，它們分別是T24、P6、F4、F9、F12、F16、F22。

初篩得到7株酵母菌，分別接入裝有葡萄汁（含100 mg/L的SO2）的三角瓶中，28℃恒溫培養(yǎng)，以總酸、總糖、酒精度、發(fā)酵力、凝聚性、產(chǎn)酒香氣為評定指標(biāo)，復(fù)篩結(jié)果見表1。可以看出：T24和F12的發(fā)酵力強、發(fā)酵殘?zhí)堑?、酒精度高和產(chǎn)酒香氣良好，故選用T24和F12為復(fù)篩菌株。

2.2復(fù)篩葡萄酒酵母菌的綜合耐受性能比較

葡萄酒酵母菌的綜合耐受性能比較結(jié)果見圖1。圖1（a）為酒精耐受性試驗結(jié)果，在接種16 h后測定結(jié)果顯示，含乙醇體積分?jǐn)?shù)6%～12%的葡萄汁已有不同程度的發(fā)酵，說明不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對F12與D254發(fā)酵延遲時間的影響不明顯，但不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對發(fā)酵速率的影響十分顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)在6%～12%之間的發(fā)酵速率的影響不大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%～15%發(fā)酵速率明顯降低。

圖1（b）耐糖試驗結(jié)果可以看出，糖溶液質(zhì)量濃度在100～200 g/L期間時，T24、F12和D254其發(fā)酵速率變化不明顯；含糖量在200～400 g/L時，T24和F12和D254發(fā)酵速率減緩，受到了高濃度糖液的抑制。

表1　酵母菌復(fù)篩結(jié)果Table 1Experimental results of further screening for seven yeast strains

從圖1（c）耐酸試驗結(jié)果可知：葡萄汁中的含酸量從8 g/L增加至18 g/L對發(fā)酵速率均有一定的影響。T24、F12和D254隨著含酸量的增加發(fā)酵速率均逐漸減慢，在含酸量達(dá)到15 g/L時發(fā)酵速率下降趨勢較快，發(fā)酵力受到了明顯抑制，含酸量達(dá)到18 g/L時，T24、F12和D254發(fā)酵極為緩慢或幾乎不發(fā)酵。試驗說明T24、F12和D254酵母菌株均有較好的耐酸性能，對酸度的適應(yīng)范圍比較廣。

圖1（d）耐SO2試驗可知：隨著SO2質(zhì)量濃度由50 mg/L增加至150 mg/L時，T24、F12和D254的發(fā)酵速率雖無太大變化，但均有下降的趨勢。F12和D254在葡萄汁中SO2質(zhì)量濃度50～100 mg/L時，發(fā)酵速率幾乎無變化，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為150 mg/L時，發(fā)酵速率減慢，SO2質(zhì)量濃度為200 mg/L時，發(fā)酵受到抑制，SO2質(zhì)量濃度為250 mg/L時，發(fā)酵幾乎不進(jìn)行。T24在SO250～100mg/L時，發(fā)酵不受影響，但相對F12和D254較慢，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為150 mg/L時發(fā)酵速率明顯下降，SO2質(zhì)量濃度200 mg/L時發(fā)酵幾乎停止，SO2質(zhì)量濃度達(dá)到250 mg/L時，無發(fā)酵跡象。SO2耐受實驗證明F12和D254的耐SO2能力較強，適應(yīng)范圍較廣，T24與F12和D254相比，受抑制現(xiàn)象比較明顯，說明T24耐SO2性能較差。

2.3優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12形態(tài)特征和生理生化特征

2.3.1優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖2。酵母菌F12的菌落為圓形，邊緣整齊，的尖峰突起，菌落為奶油色，質(zhì)地光滑濕潤，較厚，酒香氣較濃，見圖2（a）。酵母菌F12的營養(yǎng)細(xì)胞為圓形或卵圓形，生長方式是一端出芽生殖，無假菌絲，見圖2（b）。

圖1　T-24、F-12與對照菌株D254的綜合耐受性試驗結(jié)果Fig.1Results of tolerance of T24、F12 and contrast strain D254

圖2　酵母菌F12菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)Fig.2Colony morphology and cell morphology of F12

2.3.2優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12生理生化試驗結(jié)果同化氮源、碳源試驗和酒精發(fā)酵實驗結(jié)果見表2～4。

表2　優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12同化氮源試驗結(jié)果Table 2Nitrogen assimilation tests of yeast F12

表3　優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12同化碳源試驗結(jié)果Table 3Carbon assimilation tests of yeast F12

續(xù)表3

表4　優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12糖發(fā)酵試驗結(jié)果Table 4Ability of yeast F12 to ferment sugars

通過對優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、同化碳源試驗、同化氮源試驗和糖類發(fā)酵試驗的結(jié)果與《酵母菌的特征與鑒定手冊》進(jìn)行對照，檢索結(jié)果初步確認(rèn)優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12為酵母屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.4酵母菌F12分子分類學(xué)鑒定結(jié)果

使用通用引物ITS1/ITS4對優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12的5.8S rDNA-ITS區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴增（見圖3），擴增片段大小為792bp，PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)Blast軟件比對分析及5.8S rDNA-ITS區(qū)序列相似性計算，根據(jù)測序結(jié)果利用Blast軟件從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中獲取對比靠前的20個相似序列，通過Clustal X和MEGA3.1軟件進(jìn)行對比分析并以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，試驗結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

結(jié)合優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12的細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、同化碳源試驗、同化氮源試驗和糖類發(fā)酵試驗的結(jié)果與5.8S rDNA-ITS區(qū)基因序列的分子比對結(jié)果，確定酵母菌F12為酵母屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3　酵母菌F12 5.8S rDNA-ITS區(qū)基因的PCR擴增結(jié)果Fig.3Result of the PCR-amplified in 5.8S rDNA-ITS region of yeast F12

圖4　酵母菌F12與相關(guān)種的5.8S rDNA-ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA ITS region partial sequence showing the relationship between yeast F12 and related members of the family yeast

2.5優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12釀酒對照試驗

將優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12活化后，按體積分?jǐn)?shù)0.6%的接種量接種于裝有6 L新鮮葡萄漿發(fā)酵罐中，加入60 mg/L的SO228℃恒溫發(fā)酵。測定指標(biāo)：總酸、總糖、酒精度；感官指標(biāo)有酒體香氣、澄清度、滋味和酒體色澤，同時以法國葡萄酒酵母D254作為對照菌株。在完全相同的發(fā)酵條件下，F(xiàn)12與D254發(fā)酵性能比較見圖5。

圖5可知：優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12在起酵時間上與法國葡萄酒酵母D254一致，均在接種后18h開始發(fā)酵；在降糖速度方面，酵母菌F12起先略低于法國葡萄酒酵母D254，隨著發(fā)酵過程的逐步推移，酵母菌F12的發(fā)酵速率逐漸與酵母菌D254相當(dāng)，直至發(fā)酵結(jié)束，總之，酵母菌F12在發(fā)酵性能方面接近法國葡萄酒酵母菌D254。

圖5　優(yōu)勢葡萄酒酵母菌F12和D254發(fā)酵曲線Fig.5Fermentation curve of yeast F12 and yeast D254

2.6F-12和D254釀酒GC-MS揮發(fā)性成分比較

F-12和法國葡萄酒酵母D254以新疆第六師赤霞珠葡萄進(jìn)行釀酒試驗，GC-MS檢測結(jié)果見圖6。乙醛、乙酸乙酯、1-丙醇、正丁醇、1-己醇、2，3-丁二醇和丙三醇等芳香物質(zhì)二者相差不大，F(xiàn)-12中辛酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯等酯類物質(zhì)含量明顯高于法國葡萄酒酵母D254。

圖6　F-12和法國葡萄酒酵母D254發(fā)酵果酒GC-MS揮發(fā)性成分比較Fig.6Comparison between F-12 and D254 on GC-MS results of fermented wines

在完全相同的發(fā)酵條件下，酵母菌F12與D254進(jìn)行釀酒試驗，葡萄酒經(jīng)過6個月的陳釀后，進(jìn)行理化檢測和感官評價，結(jié)果見表5和表6。

由表5和表6可知：在理化指標(biāo)上用酵母菌D254和F12兩者所釀葡萄酒無太大差別；葡萄酒香氣濃郁，口感醇厚、協(xié)調(diào)，酒味干凈、無雜味。此外，以F12釀造的葡萄酒具有典型的風(fēng)格?？傊卺劸菩阅芊矫婵梢杂糜谛‘a(chǎn)區(qū)葡萄酒的釀造。

表5　葡萄酒理化分析結(jié)果Table 5Results of properties analysis to wine

表6　葡萄酒感官檢驗評分表Table 6Sensory evaluation of wine

3　結(jié)語

從新疆第六師主要葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄果實表皮、葡萄園土壤和自然發(fā)酵的葡萄醪中分離獲得了一株發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌株F12。通過糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化試驗并結(jié)合菌落特征、細(xì)胞形態(tài)，以及5.8S rDNA ITS區(qū)基因序列測序鑒定，F(xiàn)12屬于酵母屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

釀酒酵母F12生長繁殖快、發(fā)酵力強，酵母絮凝性良好，對葡萄汁具有較強的適應(yīng)能力，耐受性測試表明，F(xiàn)12菌株能在糖質(zhì)量濃度＞400 g/L，SO2質(zhì)量濃度＞200 mg/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)＞15%、含酸量＞18 g/L的葡萄汁中發(fā)酵，溫度耐受范圍為10~35℃。通過耐受性及發(fā)酵性能測試，表明菌株F12適合用于釀造葡萄酒。且發(fā)酵檢測的各項指標(biāo)都符合GB1037 2006的要求。

與法國葡萄酒酵母菌D254進(jìn)行比較，在釀酒性能方面可以替代法國葡萄酒酵母D254。菌株F12所釀干紅葡萄酒的香氣成分，經(jīng)GC-MS檢測結(jié)果顯示乙醛、1-丙醇、正丁醇、1-己醇、2，3-丁二醇和丙三醇等芳香物質(zhì)二者相差不大，F(xiàn)-12中辛酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊酸乙酯、乳酸乙酯、等酯類物質(zhì)含量明顯高于法國葡萄酒酵母D254。體現(xiàn)出釀酒酵母F12的優(yōu)良特性。

目前，對于新疆和其他產(chǎn)區(qū)酵母菌的選育的研究有相關(guān)報道，但針對新疆葡萄產(chǎn)區(qū)及其主栽品種，選育適合第六師產(chǎn)區(qū)、特定葡萄品種的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的專用釀酒酵母篩選未見報道，因此該試驗在與新疆唐庭霞露酒莊有限公司的合作下，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)具有地域特色和獨特風(fēng)格的產(chǎn)區(qū)葡萄酒，提高新疆葡萄酒產(chǎn)業(yè)的競爭力打下重要基礎(chǔ)。

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Screening，Identification and Fermentation Characteristics of Yeast from the Vineyard of the Sixth Division in Xinjiang Province

ZHENGXiaoji1，WANGShunli2，SHIXuewei1，SHANChunhui/*1
（1.School of Food Sciences，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.Xinjiang Tangting Xialu Wine Estates Co.，Wujiaqu 831300，China）

127 strains of yeast were isolated from grape epidermis，vineyard soil and natural fermented grape mash from the vineyard of the Sixth Division in Xinjiang province.After primary screening，secondary screening and comprehensive tolerance experiment，we obtained yeast strain F12 with excellent fermentation performance.According to sugar fermentation，carbon and nitrogen sources assimilation，colony characteristics，cell morphology，and 5.8SrDNA ITS region gene sequencing，F(xiàn)12 was identified as Saccharomyces cerevisiae.It was found that F12，which adapted to grape juice，has a strong fermentation ability and good flocculation.F12 could ferment in grape juice with sugar content above 400 g/L，SO2concentration above 200 mg/L，alcoholic content above 15%，acid content 18 g/L with a wide temperature range of 10℃to 35℃.F12 could ferment in grape juice with sugar content above 400 g/L，SO2concentration above 200mg/L，alcoholic content above15%，acid content 18 g/L with a wide temperature range of 10℃to 35℃.The wine fermented by F12 has characteristics of pure color，full-bodied aroma，mellow taste，coordination and typical style.

Xinjiang，Small region，Saccharomyces cerevisiae，screening，identification

TS 261.11

A

1673—1689（2015）10—1107—07

2014-12-17

新疆第六師科技計劃和重大科技專項項目（2015）。

鄭曉吉（1982—），男，甘肅定西人，講師，主要從事新疆特色酵母菌多樣性及應(yīng)用研究。E-mail：zhengxj1982@163.com

單春會（1978—），男，新疆塔城人，工學(xué)博士，副教授，主要從事新疆特色果蔬加工研究。E-mail：zhengxj229@sina.com