鄧維澤，唐顯福，古霞，閆天龍，楊文宇，李明元*，

（1.西華大學生物工程學院/四川省食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.貴州赤水仙草生物科技有限公司，貴州赤水564700）

超聲波輔助提取金釵石斛多糖工藝優(yōu)化研究

鄧維澤1，唐顯福2，古霞1，閆天龍1，楊文宇1，李明元*1，2

（1.西華大學生物工程學院/四川省食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.貴州赤水仙草生物科技有限公司，貴州赤水564700）

優(yōu)化超聲波輔助提取金釵石斛多糖工藝。以多糖提取得率為考察指標，用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，采用單因素試驗正交試驗法考察了料液比、超聲波提取功率、提取溫度和提取時間對金釵石斛多糖提取得率的影響。超聲波輔助提取金釵石斛多糖的最佳提取工藝條件為：料液質(zhì)量體積比1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時間為50 min，在此條件下多糖得率為3.11%。

金釵石斛多糖；提取；工藝優(yōu)化；正交試驗

金釵石斛，俗稱扁金釵，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物［1］，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，因其生長在特殊的環(huán)境和具有強大的滋補功效而成為“中國九大仙草”之一。金釵石斛可“益胃生津、補腎益力、延年益壽”，具有抗衰老，增強免疫力等功效［2-4］，其主要的功效成分是石斛堿及多糖類物質(zhì)。金釵石斛是國家批準可用于保健食品的物品名單之一。目前，對于金釵石斛研究大多集中在石斛堿上，對于金釵石斛多糖的研究鮮見報道。作者利用超聲波法輔助提取金釵石斛多糖，并通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，為進一步金釵石斛多糖的分離純化及其活性的研究提供一定的基礎，為金釵石斛多糖的開發(fā)及其相關產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

金釵石斛：貴州赤水仙草生物科技有限公司提供。烘干、粉碎，過40目篩，備用；透析袋：成都奧克生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器UV2800紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn)品；KQ-700DE型超聲波數(shù)控清洗儀：上海滬沁儀器設備有限公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化公司產(chǎn)品；Alphal-2LD plus冷凍干燥機：德國CHRIST公司產(chǎn)品。

1.2.2主要試劑無水葡萄糖、苯酚、硫酸、石油醚、無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿，均為分析純。

1.3方法

1.3.1試驗樣品的前處理稱取金釵石斛干燥粉末，置于索氏提取器中，加入6倍體積石油醚80℃回流提取1 h，濾渣揮干溶劑，加入10倍體積分數(shù)80%乙醇，70℃回流提取2次，每次1 h，趁熱抽濾，濾渣揮干溶劑，60℃干燥至恒重備用。

1.3.2金釵石斛粗制多糖的制備稱取1.3.1中的樣品50 g，加入500 mL蒸餾水，超聲波提?。ǔ暅囟?0℃，超聲時間60 min，超聲功率300 W），趁熱過濾，減壓濃縮，加入無水乙醇使溶液含乙醇體積分數(shù)至80%，靜止過夜，離心得沉淀冷凍干燥即為金釵石斛粗制多糖。

1.3.3金釵石斛精制多糖的制備將1.3.2中的金釵石斛粗制多糖加蒸餾水溶解，溶液用活性炭除色素，Sevage法除去蛋白質(zhì)，反復操作直至紫外-可見光掃描無明顯蛋白質(zhì)吸收峰為止。用透析袋48 h流水透析，蒸餾水透析24 h，除去無機鹽、小分子雜質(zhì)及未除盡的色素，將透析袋內(nèi)多糖液醇沉，離心得沉淀，無水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷凍干燥至恒重即金釵石斛精制多糖［5-6］。

1.3.4金釵石斛多糖含量的測定方法金釵石斛多糖測定采用改進的苯酚-硫酸法［7］，在490 nm處測定吸光值，計算多糖含量。精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品1.000 g，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，配置成10 mg/mL的葡萄糖標準儲備液。精取葡萄糖標準儲備液1.0 mL于100 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于9支比色管中，分別以水補至2.0 mL，另取1支比色管加入2.0 mL蒸餾水，作為空白對照，然后各自加入質(zhì)量分數(shù)5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，混勻后，置于40℃水浴中加熱30 min，冷水冷卻至室溫，在波長490 nm處測定吸光值。以葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，回歸方程Y=0.089 72X-0.004 6（R2=0.999 1）。

1.3.5換算因子的測定精確稱取干燥至恒重的金釵石斛精制多糖2.5 mg于50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。從中精確吸取2.0 mL，按“1.3.4”的方法測定吸光值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算多糖質(zhì)量濃度，按下式計算換算因子f=（Cs/C）。Cs為實際金釵石斛多糖的質(zhì)量濃度，C為根據(jù)標準曲線計算出的質(zhì)量濃度。由計算的結(jié)果可得換算因子f=1.32（n=3），純度=1/f=1/1.32=75.76%。

1.3.6金釵石斛多糖得率測定取金釵石斛提取工藝中制備的多糖稀釋液2 mL，按“1.3.4”操作，測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算多糖稀釋液的質(zhì)量濃度。金釵石斛多糖得率=（f·C·N·V/m）；式中f為換算因子，C為根據(jù)標準曲線計算出的多糖稀釋液質(zhì)量濃度值，N為稀釋倍數(shù)，V為提取工藝中的濾液體積，m為試驗樣品的質(zhì)量。

1.3.7金釵石斛多糖提取單因素試驗準確稱取前處理干燥的金釵石斛粉3.0 g，放入200 mL的錐形瓶中，以水作為提取溶劑，在其他條件相同的情況下，采用不同的料液比、超聲波功率、提取時間、提取溫度進行超聲波輔助提取試驗，然后趁熱過濾，精確測定濾液體積（V）。用移液管精確移取1 mL濾液于50 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（稀釋倍數(shù)N），用“1.3.4”的方法測定金釵石斛多糖的質(zhì)量濃度，計算金釵石斛多糖得率，逐個考察各提取條件對提取效果的影響，確定每一因素的最佳水平。

1.3.8金釵石斛多糖提取正交試驗根據(jù)1.3.7單因素試驗結(jié)果，選取料液比、超聲波功率、時間、溫度4個因素及3個最佳水平進行正交試驗L9（34），超聲波輔助提取后按“1.3.4”的方法測定金釵石斛多糖的質(zhì)量濃度，并計算多糖得率，確定金釵石斛多糖提取的最佳條件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1料液比對多糖得率的影響在超聲波功率400 W、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間50 min的條件下，依1.3.7的試驗方法，研究料液質(zhì)量體積比對多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。當料液質(zhì)量體積比大于1 g∶20 mL時，金釵石斛多糖提取得率隨料液比的減小而提高，當料液質(zhì)量體積比小于1 g∶20 mL時，金釵石斛多糖提取率隨料液比繼續(xù)減小，反而出現(xiàn)多糖提取率稍微下降的情況，從實驗條件和后期處理成本出發(fā)，選擇1 g∶20 mL為最佳料液質(zhì)量體積比。

圖1　料液質(zhì)量體積比對多糖得率的影響Fig.1Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysccharides

2.1.2超聲波提取功率對多糖得率的影響在料液質(zhì)量體積比1 g∶20 mL、超聲波提取溫度50℃、超聲波提取時間50 min的條件下，依1.3.7的試驗方法，研究超聲波提取功率為300、350、400、450、500、550 W時對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，金釵石斛多糖提取得率隨著超聲波提取功率增大，先增大而后減小的趨勢，在超聲波功率低于450 W時，多糖得率隨超聲波功率的增大而提高，在超聲波功率高于450 W時多糖得率又隨超聲波功率的增大而降低，可能是由于大的超聲波提取功率所產(chǎn)生機械效應作用使多糖的糖苷鍵被打斷，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，使多糖得率降低［8-9］。因此選擇450 W為最佳超聲波提取功率。

圖2　超聲波提取功率對多糖得率的影響Fig.2Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysccharides

2.1.3超聲波提取溫度對多糖得率的影響在料液質(zhì)量體積比1 g∶20 mL、超聲波提取功率450 W、超聲波提取時間50 min的條件，依1.3.7的試驗方法，研究超聲波提取溫度為40、50、60、70、80℃時對多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，金釵石斛多糖提取率隨著超聲波提取溫度的升高而增大，在40～60℃時，多糖得率隨溫度的升高而呈顯著性增加，在60℃以后，多糖得率隨溫度的升高而極度緩慢的增加，從節(jié)約能源角度考慮，因此選擇60℃為最佳超聲波提取溫度。

圖3　超聲波提取溫度對多糖得率的影響Fig.3Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of polysccharides

2.1.4超聲波提取時間對多糖得率的影響在料液質(zhì)量體積比1 g∶20 mL、超聲波提取功率450 W、超聲波提取溫度60℃的條件，依1.3.7的試驗方法，研究超聲波提取時間為10、30、50、70、90 min時對多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。在超聲波提取時間10～50 min的范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，金釵石斛多糖提取得率也隨之提高，但是超過50 min后，繼續(xù)延長超聲波提取時間，金釵石斛多糖得率不再提高反而降低。這可能是超聲波處理時間短，多糖溶出不完全；處理時間過長，可能對會破壞多糖結(jié)構(gòu)，影響金釵石斛多糖得率。因此選擇40～60 min之間為最佳的超聲波提取時間。

圖4　超聲波提取時間對多糖得率的影響Fig.4Effect of ultrasonic treatment temperature on extraction rate of polysccharide

2.2正交試驗結(jié)果

金釵石斛多糖提取效果受多個因素的交叉影響。上述試驗只是單因素影響，為了確定在提取過程中這4個因素對金釵石斛多糖提取效果的影響大小，選出最佳的提取條件。依“1.3.8”的試驗方法，正交試驗設計見表4，正交試驗結(jié)果見表5所示。

由表5可知，從極差R的大小可以看出影響金釵石斛多糖提取的4個因素的主次關系是：超聲波提取功率＞超聲波提取時間＞料液質(zhì)量體積比＞超聲波提取溫度。因素C的極差很小，所以將此列作為方差分析的誤差列［10］，結(jié)果見表6。F檢驗表明，B因素（超聲波提取功率）P＜0.01，D因素（超聲波提取時間）P＜0.05，說明在B因素所設的不同水平下對金釵石斛提取效果有極顯著性差異，在D因素所設不同水平下有顯著性差異，其他因素各水平間差異均不顯著。

從正交試驗結(jié)果可以看出金釵石斛多糖得率最高的提取組合是A1B2C2D2，即料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時間為50 min。單因素試驗中的4個單因素的最佳組合為A2B2C2D2，即料液質(zhì)量體積比為1 g∶20 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時間為50 min。下面對兩者進行比較：提取功率、提取溫度、提取時間相同，料液質(zhì)量體積比的差異性不顯著，可以忽略不計。考慮小的料液質(zhì)量體積比會給后續(xù)提取液的濃縮帶來困難以及節(jié)約能源，所以選擇1 g∶ 15 mL的料液質(zhì)量體積比更科學，更合理。綜上所述，本試驗條件下確定最最佳的提取條件為料液質(zhì)量體積比為1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時間為50 min。

表4　正交試驗4因素3水平L9（34）表Table 4Four factors and three levels of L9（34）of the orthogonal test

表5　正交試驗結(jié)果的直觀分析表Table 5Results of the orthogonal test

表6　方差分析表Table 6Analysis of Variance table

3　結(jié)語

1）通過單因素及正交試驗得出了超聲波輔助提取金釵石斛多糖的最佳提取工藝條件為：料液質(zhì)量體積比1 g∶15 mL，超聲波提取功率為450 W，超聲波提取溫度為60℃，超聲波提取時間為50 min。在此條件下金釵石斛多糖的提取得率達3.11%，各個因素對金釵石斛多糖得率的影響作用大小順序依次為超聲波提取功率＞超聲波提取時間＞料液比＞超聲波提取溫度，這為金釵石斛多糖的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

2）金釵石斛多糖超聲波輔助提取法與熱水回流提取法、水煎煮提取法比較見表7。

3）超聲波輔助提取是否影響金釵石斛活性多糖的結(jié)構(gòu)、破壞金釵石斛多糖的生物活性，還值得以后做進一步的研究和論證。

表7　不同金釵石斛多糖提取法比較Table 7Comparison of different extraction methods for Dendrobium nobile Lindl.polysaccharides

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.

DENG Weize1，TANG Xianfu2，GU Xia1，YAN Tianlong1，YANG Wenyu1，LI Mingyuan*1，2
（1.College of Bioengineering/Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Province，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Guizhou Chishui Xian Cao Biological Technology Co.，Ltd，Chishui 564700，China）

The study aimed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.Using extraction rate as evaluation index，the polysaccharide content was assayed by the phenol-sulfuric method.Based on the orthogonal test，the optimal ultrasonic-assisted extraction conditions were：material-liquid ratio 1∶15（g/mL），extraction power 450 W，temperature 60℃and time 50 min.With the optimal conditions，the extraction rate of polysaccharides was up to 3.11%.

Dendrobium nobile Lindl.polysaccharides，extraction，process optimization，orthogonal test

R 931.71

A

1673—1689（2015）10—1101—06

2014-09-17

貴州省遵義市中藥重大專項赤中藥科合（201306）。

李明元（1965—），男，四川瀘州人，農(nóng)學博士，教授，主要從事食品質(zhì)量安全及營養(yǎng)保健研究。E-mail：limingyuan 519@qq.com