李周勇，陳云，史玉東，母智深

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳中優(yōu)質(zhì)乳桿菌的篩選與鑒定

李周勇，陳云，史玉東，母智深*

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特011500）

從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗多戶牧民家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，共分離得到36株乳桿菌。經(jīng)發(fā)酵特性試驗篩選，共得到2株同時具有優(yōu)良產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。經(jīng)16s rDNA鑒定與API50輔助鑒定，確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2、WSQ-34為植物乳桿菌1。將兩株乳桿菌與嗜熱鏈球菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵試驗，并與市售酸奶對照，最終確定WSQ-18為試驗菌株，具有作為酸奶發(fā)酵劑的可能性。

乳酸桿菌；發(fā)酵特性；種屬鑒定；復(fù)配

乳酸菌廣泛存在于自然環(huán)境中［1］，可以從生鮮乳及傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到，經(jīng)過進(jìn)一步純化、培養(yǎng)和傳代，以及和其它具有不同生理特征和發(fā)酵代謝特征的菌種混合，從而得到具有不同特征的新型發(fā)酵乳制品，然后可進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。我國牧區(qū)大部分傳統(tǒng)乳制品的制作方法都有其獨(dú)特的戶籍性和地域性［2］，因此所產(chǎn)出的發(fā)酵乳制品便也同時具備了濃重的地域性特色和獨(dú)特風(fēng)味。

內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗地區(qū)的原住居民千百年來始終沿襲當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)而古老的制作方法發(fā)酵乳制品［3］。制作工藝簡單、口感純正、組織細(xì)膩、產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)具特色，而且在保證其狀態(tài)和口感的條件下，還能在自然溫度下保存較長時間。這表明這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中極有可能含有凝乳狀態(tài)穩(wěn)定、傳代性能好以及產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)良乳酸菌株［4］。在此基礎(chǔ)上，試驗采集了內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗本地牧民家庭的3份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，希望從中篩選出具有優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)黏性能的乳桿菌，應(yīng)用于酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1）試驗菌株：36株乳桿菌（采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗多個牧民家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳，超低溫冰箱-80℃保存）；現(xiàn)有菌株，嗜熱鏈球菌MN12（蒙牛乳業(yè)微生物工作室保存）。

2）培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、API50CHL培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；脫脂乳培養(yǎng)基［12%（g/mL）的脫脂乳、115℃滅菌15 min］。

3）試劑：市售原味酸奶（維多利超市）；脫脂乳粉、甘油、酞批示劑、結(jié)晶紫染液、番紅染液、氫氧化鈉等（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.2設(shè)備

G560E漩渦混合器：美國SCIENTIFIC Instruments公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；Premium U410超低溫冰箱：美國NBS公司；HV-110高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；SVE-6A1超凈臺：新加坡ES CO公司；LVDV-Ⅱ+P旋轉(zhuǎn)式粘度計：美國Brookfield公司；Sartorius pH酸度計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3方法

1.3.1乳桿菌的純化

超低溫冰箱-80℃保存的菌株采用脫脂乳培養(yǎng)基傳代活化，之后采用MRS瓊脂培養(yǎng)基劃線接種，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于MRS斜面培養(yǎng)基上純培養(yǎng)。對培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢［5］，直到確認(rèn)為純菌種。采用MRS半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，菌種于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)粘菌株的篩選

1）酸度的測定

樣品后熟24h后，采用國標(biāo)酸堿滴定法測定酸度［6］。

2）黏度的測定

采用LVDV-Ⅱ+P旋轉(zhuǎn)式粘度計進(jìn)行一點式測定［7］，根據(jù)樣品的黏度范圍最終選擇63號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速50 r/min，在測定溫度4℃條件下，測試10 s記數(shù)，重復(fù)測量3次取算術(shù)平均值。黏度單位為mPa·s。

3）發(fā)酵特性試驗

凝乳時間：將活化好的菌株以3%的接菌量接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的脫脂乳中，于43℃條件下恒溫發(fā)酵，每隔0.5 h測定一次樣品的pH。待樣品pH降低到4.6或以下，記錄菌株發(fā)酵脫脂乳至凝乳的時間。

產(chǎn)酸速度：分別測定發(fā)酵初始和發(fā)酵15 h后樣品的pH和酸度，計算平均每小時樣品pH和滴定酸度的變化量即為菌株的產(chǎn)酸速度［8］。

后酸化度：脫脂乳接菌后在培養(yǎng)過程中，分別在第15小時和60小時取出，測定樣品的pH和滴定酸度。在第15小時至60小時的培養(yǎng)過程中，每小時pH和酸度的平均變化量，即表示為后酸化度［9］。

黏度測定：根據(jù)試驗結(jié)果，保留初始凝乳時間≤6 h的菌株，并選取其中產(chǎn)酸速度快、后酸化程度弱的菌株。待樣品凝乳后取出，破乳并于4℃冰箱內(nèi)后熟24 h，取出測定黏度。

1.3.3菌株種屬鑒定

1）菌株16 s rDNA鑒定［10］

PCR擴(kuò)增：PCR體系50μL，反應(yīng)條件：95℃/5 min， 95℃/40 s，50℃/40 s，72℃/1 min，進(jìn)行31個循環(huán)；72℃/ 5 min，收集PCR產(chǎn)物，由天津生物芯片有限公司測序。

2）菌株API50輔助鑒定［11］

采用16s rDNA進(jìn)行種屬鑒定，其結(jié)果有時可能會與兩個或多個種屬同源性達(dá)到95%以上的相同數(shù)值，因而無法將菌株鑒定至種。API50CHL適用于乳酸桿菌（Lactpbacillus）和相關(guān)菌的鑒定，它是由49種可發(fā)酵碳水化合物的API 50 CH試驗條組成的簡易培養(yǎng)基。結(jié)合16s rDNA鑒定結(jié)果，采用API50CHL鑒定的方法，可將乳桿菌進(jìn)一步鑒定至種水平。

1.3.4混合發(fā)酵試驗［12］

將發(fā)酵特性試驗篩選出的優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)黏乳桿菌與實驗室保留的嗜熱鏈球菌按1∶1的接菌比例，2%的總接菌量進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵酸奶，以市售原味酸奶為對照。在后熟24 h后測定樣品各項指標(biāo)的變化，分析評價篩選所得菌株作為酸奶發(fā)酵劑的可行性。

1）酸奶的制作流程［13］

牛奶（雜菌＜500 000 CFU/mL，酸度＜18°T）→配入7%的白砂糖，攪拌乳化1 h→均質(zhì)（壓力為20 MPa）→加熱殺菌（95℃、5 min）→冷卻至43℃→加入發(fā)酵劑（接種量3%）→42℃下恒溫發(fā)酵→攪拌冷卻→4℃后熟24 h

2）乳清析出率［14］

將100 g酸奶從4℃貯藏條件下取出，立即倒入大漏斗（帶有120目不銹鋼絲網(wǎng)），從下方收集析出的乳清，2 h后稱量乳清重量。

3）黏稠度

采用LVDV-Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)黏度計進(jìn)行一點測定，通過試驗最終選擇28號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為50 r/min，在常溫下，測試30 s記數(shù)，重復(fù)測量3組取平均值。黏度單位為mPa·s。

4）感官評定

由10名蒙牛乳業(yè)乳品研發(fā)團(tuán)隊的專業(yè)人員組成品評小組，對樣品的總體色澤、滋氣味、組織狀態(tài)等進(jìn)行評分?？偡郑?0分的，定為優(yōu)質(zhì)酸奶；總分在80分～90分之間的，定為良質(zhì)酸奶；總分＜80分的，定為次質(zhì)酸奶。感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2結(jié)果與分析

2.1乳桿菌的分離純化結(jié)果

從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗多戶牧民家庭自制的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，通過前期采用革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗相結(jié)合的方法［16］，初步篩選出62株乳酸菌，經(jīng)進(jìn)一步鏡檢純化試驗，確認(rèn)共得到乳桿菌36株，并依次命名為“WSQ-”系列。

表1　感官評定標(biāo)準(zhǔn)［15］Table 1Standard of organoleptic investigatio

2.2優(yōu)良產(chǎn)酸、產(chǎn)黏菌株的篩選結(jié)果

2.2.1菌株產(chǎn)酸試驗結(jié)果

2.2.1.1菌株凝乳時間測定結(jié)果

菌株凝乳時間測定結(jié)果見表2。

表2　菌株凝乳時間Table 2The time of strain curding

由表2可以看出，活化好的菌株在43℃條件下恒溫發(fā)酵，6 h內(nèi)能發(fā)酵脫脂乳至凝乳的菌株共有9株，它們分別是：WSQ-05、WSQ-09、WSQ-13、WSQ-18、WSQ-19、WSQ-24、WSQ-28、WSQ-30、WSQ-34，其中WSQ-09的凝乳時間最短，為3.5 h。因此，保留這9個菌株繼續(xù)進(jìn)行其它產(chǎn)酸試驗。

2.2.1.2菌株產(chǎn)酸速度及后酸化程度測定結(jié)果

菌株產(chǎn)酸速度及后酸化程度測定結(jié)果見表3。

由表3可以看出，WSQ-09、WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34四株菌的產(chǎn)酸速度相對較快，與其它菌株差異顯著。其中，WSQ-09菌株的后酸化程度嚴(yán)重，表明在15 h～60 h的培養(yǎng)過程中，產(chǎn)品的pH和酸度的變化過快。因此，選擇后酸化弱的3株菌WSQ-18、WSQ-30、WSQ-34繼續(xù)進(jìn)行產(chǎn)黏試驗。

表3　菌株產(chǎn)酸速度及后酸化程度測定結(jié)果Table 3Measurement results of speed of strains produce acid and degree of after acidification

2.2.2菌株產(chǎn)黏試驗結(jié)果

經(jīng)4℃冰箱內(nèi)后熟24 h，樣品黏度如表4所示。

表4　菌株產(chǎn)黏試驗結(jié)果Table 4Test results of strains produce viscosity

由表4可以看出，經(jīng)4℃條件下后熟24 h后，WSQ-18和WSQ-34發(fā)酵樣品的黏度值較大，分別為1 214.5 mPa·s和1 243.4 mPa·s，與WSQ-30樣品的黏度值差異顯著。

根據(jù)試驗結(jié)果，初步篩選出兩株具有優(yōu)良產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。試驗最終選擇WSQ-18及WSQ-34作為試驗菌株，進(jìn)行下一步種屬鑒定及混合發(fā)酵試驗。

2.3菌株種屬鑒定試驗結(jié)果

2.3.1菌株16s rDNA鑒定結(jié)果

經(jīng)16s rDNA鑒定，結(jié)果表明，菌株WSQ-18與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16s rDNA基因序列有著高達(dá)99.9%的同源性，可初步確定WSQ-18為德氏乳桿菌。WSQ-34與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）的16s rDNA基因序列有著相同的100%的同源性，暫時無法確定其種屬。

2.3.2菌株API50輔助鑒定結(jié)果

菌株WSQ-18和WSQ-34經(jīng)API 50 CH試驗條的49種可發(fā)酵碳水化合物反應(yīng)所得的生化圖譜如下圖1所示。

圖1　菌株WSQ-18及WSQ-34的API50鑒定圖譜Fig.1API50 identification map of WSQ-18 and WSQ-34

根據(jù)WSQ-18、WSQ-34的API50生化圖譜圖，與API50生化圖譜標(biāo)準(zhǔn)對照表比對［17］，最終確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2），WSQ-34為植物乳桿菌1（Lactobacillus plantarum 1）。

2.3.3菌株混合發(fā)酵試驗結(jié)果

菌株混合發(fā)酵試驗結(jié)果見表5。

表5　混合發(fā)酵試驗結(jié)果Table 5Test results of mixed fermentation

由表5可以看出，經(jīng)后熟24 h后，兩個試驗組樣品的乳清析出率略高于對照組，但無顯著差異。WSQ-18+MN12組樣品的黏度與對市售酸奶無明顯差異，WSQ-34+MN12組樣品的黏度低于市售酸奶且差異顯著。經(jīng)專業(yè)人員感官品評，WSQ-18+MN12組與對照組品質(zhì)接近，均為優(yōu)質(zhì)酸奶，WSQ-34+MN12組與對照組相比，品質(zhì)有所下降，為良質(zhì)酸奶。因此，根據(jù)以上試驗結(jié)果，考慮到今后可能用于生產(chǎn)實際，試驗最終選擇WSQ-18（德氏乳酸桿菌乳酸亞種2）為試驗確定菌株。

3結(jié)論

試驗從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中共分離得到36株乳桿菌。經(jīng)發(fā)酵特性試驗篩選，共得到2株具有優(yōu)良產(chǎn)酸和產(chǎn)黏特性的乳桿菌，它們分別是WSQ-18和WSQ-34。經(jīng)16s rDNA與API50鑒定，確定WSQ-18為德氏乳酸桿菌乳酸亞種2（Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2）、WSQ-34為植物乳桿菌1（Lactobacillus plantarum 1）。經(jīng)菌株混合發(fā)酵試驗，最終選擇WSQ-18（德氏乳酸桿菌乳酸亞種2）作為目標(biāo)菌株。

［1］孫天松，王俊國，張列國.中國新疆地區(qū)酸馬奶中乳酸菌生物多樣性研究［J］.微生物學(xué)通報，2007，34（3）:451-454

［2］康白，袁杰利.乳酸菌的微生態(tài)研究進(jìn)展［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17（3）:237-239

［3］劉蔭武，張以芳，趙本揚(yáng).云南省乳品中乳桿菌的鑒定［J］.微生物學(xué)通報，1993，20（4）:203-206

［4］楊潔彬，張新華.乳酸菌-生物學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1996

［5］Clayton R A，Sutton G，Hinkle PS，et a1.Intraspeeifie variation in small subunit rRNA sequences in GenBank:Why single sequences may not adequately represent prokaryotic taxa［J］.Int Syst Bcateriol，1995，45（3）:595-599

［6］趙斌，何紹江.微生物學(xué)實驗［M］.北京:科學(xué)出版社，2004

［7］凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1999:1-184

［8］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:1-42

［9］張和平，張列兵.現(xiàn)代乳品工業(yè)手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2005:250-251

［10］Elisabeth J Fabera，Pieternella Zoonb，Johannis P Kamerling，et al. The exopolysaccharides produced by Streptococcus thennophihm Rs have the same repeating unit but differ in viscosity of their milk culture［J］.Carbohydrale Research，1998，310:26-76

［11］Kolbert C P，Persing D H.Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens［J］.Curr Microbid，1999，2（3）: 229-305

［12］劉麗波，李春，孟祥晨.1株高產(chǎn)EPS嗜熱鏈球菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.中國食品學(xué)報，2007，7（3）:64-68

［13］范宇，陳歷俊，趙常新.酸奶質(zhì)構(gòu)影響因素研究進(jìn)展［J］.中國乳品工業(yè)，2009，37（7）:30-34

［14］朱秋勁，王電，陳廷昌.酸奶加工的全程物理性質(zhì)變化的研究［J］.食品科學(xué)，2003，24（2）:44-48

［15］韓育梅，孫吉.馬鈴薯丁二酸酯化交聯(lián)淀粉在攪拌型酸奶中的應(yīng)用研究［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，30（1）:149-153

［16］Warda S Abdelgadira，Siddig H Hamadb，Peter L Mllerc，et al.Characterisation of the dominant microbiota of Sudanese fermented milk Rob［J］.International dairy journal，2001（11）:63-70

［17］潘道東，吳玲.高產(chǎn)胞外多糖（EPS）乳酸菌菌株的篩選與鑒定冊［J］.食品科學(xué)，2007，28（3）:171-174

Screening and Identification for Lactobacillus from Traditional Fermented Dairy in Inner Mongolia

LI Zhou-yong，CHEN Yun，SHI Yu-dong，MU Zhi-shen*
（InnerMongoliaMengNiuDairyIndustry（Group）Co.，Ltd.，R&DCenter，Hohhot011500，InnerMongolia，China）

Test isolated 36 Lactobacillus strains in total from traditional fermented dairy which made by several herding families in Wushen league of Inner Mongolia.By screening of fermentation characteristic test，2 Lactobacillus with excellent acid and viscosity-producing characteristics were got，they were WSQ-18 and WSQ-34.By 16 s rDNA appraisal and API50 auxiliary appraisal，determine the WSQ-18 for Lactobacillus delbrueckii ssp lactis 2，WSQ-34 for Lactobacillus plantarum 1.The mixed fermentation experiment was carried out with two strains of Lactobacillus and streptococcus thermophilus，and compared with commercially available yogurt，determine the WSQ-18 for target strains eventually，as the possibility of yoghurt starter cultures.

Lactobacillus；fermentation characteristics；species identification；compound

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.037

2014-04-15

李周勇（1987—），男（漢），助理工程師，碩士研究生，研究方向：乳制品研究與開發(fā)。

母智深，副教授，主要從事乳品營養(yǎng)與工程方面的研究。